利那鲁肽对高糖诱导的人内皮集落形成细胞生物学行为的影响及机制

摘要

目的：近年来糖尿病的发病率不断攀升，糖尿病血管并发症已严重威胁到糖尿病患者的生活质量。研究发现调节干细胞，替代、修复损伤细胞或者改变细胞生物学行为从而治疗或改善糖尿病血管并发症有着广泛的治疗前景。内皮集落形成细胞（ECFC）作为内皮祖细胞（EPCs）的一个亚型，在修复血管损伤、促进血管新生方面有着重要的作用。然而，在高糖情况下，ECFC的增殖、迁移、成管能力都有不同程度的损伤，但其具体机制尚不明确。最新的研究显示，利那鲁肽能够显著降低2型糖尿病患者的心血管患病风险，其在降糖、减轻体重等以外的作用机制还有待深入研究。因此，我们选择近年研究提示生物学活性更强的 ECFC为对象，体外构建高糖模型，从检测 ECFC的增殖、衰老、迁移、成管入手，探究其改变规律与沉默信息调节因子（Sirtuins）、血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素（Angiogenin）蛋白表达的关系；同时给予合适浓度利那鲁肽干预，探究利那鲁肽是否能通过Sirt1、VEGF、血管生成素调节ECFC的增殖、衰老、迁移、成管能力。
　　方法：实验首先采集健康成人外周血，利用密度梯度离心法分离获取人外周血中的单个核细胞，采用EBM-2全套培养基诱导培养出ECFC，并传代培养。分三组处理细胞，即正糖组(NG5.5mmol/LD-葡萄糖×6d)，高糖组（HG30mmol/L D-葡萄糖×6d），渗透压组（OSM5.5mmol/L D-葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇×6d）。采用 EdU实验、β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）检测、Transwell实验、成管实验分别检测三组细胞的增殖、衰老、迁移、成管情况；采用免疫印迹法测定三组细胞Sirtuins（Sirt1-Sirt7）、VEGF、血管生成素蛋白表达水平；随后采用Western blot摸索高糖环境下（30mmol/L D-葡萄糖）利那鲁肽（Liraglutide）浓度梯度（0、25、50、75、100、125nmol/L）。在得到利那鲁肽干预最佳浓度后，分四组处理细胞，即正糖组(NG5.5mmol/L D-葡萄糖×6d)，正糖干预组（NG+Lira5.5mmol/L D-葡萄糖+100nmol/L Liraglutide×6d），高糖组（HG30mmol/L D-葡萄糖×6d），高糖干预组（HG+Lira30mmol/L D-葡萄糖+100nmol/L Liraglutide×6d），以观察利拉鲁肽对细胞VEGF、血管生成素的蛋白表达水平和细胞的增殖、衰老、迁移、成管情况。
　　结果：⑴与正糖组（5.5mmol/L D-葡萄糖）ECFC相比,高糖组（30mmol/L D-葡萄糖）细胞的增殖、迁移、成管能力下降，同时细胞衰老增加，差异具有统计学意义；且该变化与升高的渗透压浓度无关。⑵与正糖组（5.5mmol/L D-葡萄糖）ECFC相比,高糖组（30mmol/L D-葡萄糖）细胞Sirtuins蛋白表达水平普遍下调，其中Sirt1、Sirt2、Sirt7差异具有统计学意义；VEGF和血管生成素的蛋白表达明显下降，差异均具有统计学意义；且该变化同样与升高的渗透压浓度无关。⑶ECFC经高糖（30mmol/L D-葡萄糖）+（0、25、50、75、100、125nmol/L Liraglutide）干预后，随着利那鲁肽浓度的升高，Sirt1的蛋白表达水平也呈升高趋势，从50 nmol/L时开始有统计学意义，且在100nmol/L时达到平台。⑷与高糖组（30mmol/LD-葡萄糖） ECFC相比，高糖干预组（30mmol/LD-葡萄糖+100nmol/L Liraglutide）细胞VEGF和血管生成素的蛋白表达水平升高，差异具有统计学意义；且细胞的增殖、迁移、成管能力提高，细胞衰老率下降，差异具有统计学意义；而正糖（5.5mmol/LD-葡萄糖）情况下，利那鲁肽则无此效应。
　　结论：①高糖可加速ECFC衰老，引起增殖、迁移能力下降和血管生成障碍。②ECFC血管生成能力下降的同时，伴高糖诱导的Sirtuins、VEGF和血管生成素的表达下调。③利那鲁肽可显著改善高糖所致的ECFC衰老；增强增殖、迁移和血管生成能力，部分可能与上调 Sirt1、VEGF和血管生成素的表达有关。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

1材料与方法

1.1实验仪器及试剂

1.2实验方法

1.3统计学处理

2结果

2.1各组细胞生物学行为

2.2各组细胞Sirtuins、VEGF、Angiogenin蛋白表达

2.3利那鲁肽干预后各组细胞生物学行为

3讨论

3.1血管生成与内皮集落形成细胞

3.2高糖下内皮集落形成细胞的生物学行为改变

3.3高糖下内皮集落形成细胞Sirtuins的蛋白表达

3.4利那鲁肽对高糖下内皮集落形成细胞的调节作用

4结论

4.3高糖情况下，经适当浓度利那鲁肽干预，内皮集落形成细胞的衰老减少；增殖、迁移和血管生成能力增强，同时伴有上调Sirt1、VEGF和血管生成素的表达

参考文献

文献综述:内皮祖细胞治疗糖尿病足的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文