褪黑素对新生鼠高氧肺损伤的保护作用及机制研究

摘要

研究背景与目的:氧疗是重症新生儿救治中不可或缺的一部分,但若长时间暴露于高氧环境中,也会对机体产生损害,影响肺组织的生长发育,导致肺组织结构和功能异常,最终导致高氧肺损伤,影响患儿的生存质量。高氧肺损伤的发生机制十分复杂,在长时间高浓度氧气吸入下,高活性分子的产生及氧化应激反应在高氧肺损伤的发生发展过程中起着十分重要的作用,氧化应激与新生儿高氧肺损伤的关系近年来也受到了业内学者越来越多的关注。褪黑素作为人体重要的抗氧化因子之一,参与了许多至关重要的生理病理过程,研究表明,褪黑素可以通过减轻氧化应激对肺组织起到保护作用,但具体的作用机制尚不完全明确。蛋白酪氨酸激酶/信号转导与转录激活因子(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription,JAK/STAT)信号通路是体内许多细胞因子转导的共同途径,有学者发现褪黑素和JAK/STAT信号通路密切相关,但具体机制尚不清楚。本研究通过建立新生鼠高氧肺损伤动物模型,探讨褪黑素对高氧诱导新生鼠肺损伤的保护作用,通过观察褪黑素干预对新生鼠肺组织JAK2/STAT3信号通路表达的影响,探讨褪黑素对新生鼠高氧肺损伤的作用及可能的机制,以期为褪黑素应用于临床防治新生儿高氧肺损伤提供实验基础和理论依据。材料与方法:在实验的第一部分,将生后0-1天的SFP级新生SD鼠共108只,随机分为A-F共6组,每组18只。根据高氧肺损伤造模文献,将B、C、D、E、F组新生鼠分别放置于氧浓度≥80%的大小相同的透明氧箱内,每天固定时间开箱30分钟,B组不做任何处理,C组给予0.2ml溶媒(2%乙醇)腹腔注射,D组给予褪黑素(5mg/kg)等体积注射;E组给予褪黑素(10mg/kg)等体积注射;F组给予褪黑素(15mg/kg)等体积注射;A组置于同样大小的氧箱中,氧浓度21%。每天固定时间观察各组新生鼠的一般情况,在造模的第3、7、14天分别为新生SD鼠称重,在第3、7、14天从每组随机选取6只新生鼠,采用颈椎脱臼法处死,迅速取出肺组织,记录各组新生鼠肺组织外观情况,进行湿/干重比值(W/D)的测量;将肺组织置于4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋后制作病理切片,HE染色后在普通光学显微镜下观察并记录肺组织病理情况。在实验第二部分,将54只新生SD鼠随机分为空气组、高氧组及褪黑素干预组,每组18只,在实验第3、7、14天从每组随机选取6只新生鼠,采用颈椎脱臼法处死,迅速取出肺组织,制备肺组织匀浆检测新生鼠肺组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的水平;免疫印迹(Western-blot,WB)检测新生鼠肺组织JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达水平。结果:1.一般情况:空气组新生鼠在整个实验过程中活动多,反应好,体重增长好,高氧组新生鼠随高氧暴露时间的延长,逐渐出现活动量减少、体重增长缓慢、反应迟钝等表现,经褪黑素干预后暴露于高氧环境下的新生鼠一般情况优于高氧组,在实验各时间点体重大于高氧组。2.肺组织外观:空气组在实验的三个时间节点肺组织外观均呈浅粉色,质地软,弹性好,未见水肿、出血及坏死;高氧组在实验第3天时肺组织外观呈浅粉色,质地软,弹性可,可见轻微水肿及出血,随高氧暴露时间延长,肺组织颜色逐渐变成苍白色,伴有明显水肿、出血及坏死;褪黑素干预组相比于高氧组肺组织外观有不同程度的改善,其中褪黑素(10mg/kg)干预组改善最明显。3.肺组织湿/干重(W/D):在实验第7天、第14天高氧组新生鼠W/D值均高于空气,褪黑素干预后新生鼠肺组织的W/D值低于高氧组,其中褪黑素(10mg/kg)干预组改善最明显。4.肺组织HE染色:空气组各时间点肺泡结构清晰,肺间隔无增厚,肺泡腔内未见炎性细胞浸润;高氧组在实验第3天肺泡腔内有少量的炎性细胞浸润,在实验的第7天及第14天,出现肺组织结构紊乱,肺间隔增宽,伴大量炎性细胞浸润,褪黑素干预组在各时间点较高氧组肺组织病理有明显改善。5.肺组织匀浆检测:在实验的各时间点取新生鼠肺组织匀浆检测SOD、CAT、MPO活性及MDA含量,褪黑素干预组新生鼠SOD、CAT活性在实验各时间点与空气组、高氧组相比均明显升高,而褪黑素干预组MPO活性、MDA含量较高氧组明显降低。6.Western blot检测:褪黑素干预组可以促进JAK2、STAT3磷酸化,在实验各时间点,褪黑素干预组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平显著高于高氧组及空气组。结论:1.持续高浓度氧气吸入可以导致肺组织病理损伤,褪黑素干预可以减轻高氧诱导的肺损伤,最佳的褪黑素干预浓度可能为10mg/kg。2.氧化应激参与了高氧肺损伤过程,褪黑素可明显减轻肺组织氧化应激,其作用机制可能与JAK2/STAT3信号通路相关。

目录

摘要

Abstract

前言

第一章 褪黑素对新生鼠高氧肺损伤的保护作用研究

1 引言

2 实验材料

2.1 实验动物

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器

2.4 主要试剂的配制

3 实验方法

3.1 实验分组

3.2 模型制备

3.3 组织取材

3.4 一般情况

3.5 体重

3.6 肺组织外观

3.7 湿干重比值

3.8 HE染色

3.9 统计分析

4 实验结果

4.1 一般情况

4.2 体重变化

4.3 肺组织外观

4.4 湿/干重比值

4.5 病理表现

5 讨论

6 结论

第二章 褪黑素对新生鼠高氧肺损伤的保护作用机制研究

1 引言

2 实验材料

2.1 实验动物

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器

3 实验方法

3.1 实验分组

3.2 模型制备

3.3 组织取材

3.4 肺组织匀浆检测SOD、CAT、MPO活性及MDA含量

3.5 Western blot检测肺组织JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达水平

3.6 统计分析

4 实验结果

4.1 褪黑素对肺组织SOD、CAT、MPO活性及MDA含量的影响

4.2 褪黑素对JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达的影响

5 讨论

6 结论

全文结论

参考文献

文献综述 褪黑素减轻新生儿肺损伤的抗氧化机制研究进展

参考文献

附录

攻读学位期间的研究成果

致谢