葛根等中药材高效液相色谱指纹图谱的研究

摘要

HPLC色谱指纹图谱的建立，主要是最佳色谱条件的确定，第一要考虑色谱柱，一般选择C18反相柱。针对生物碱类可选用离子交换柱，对于多糖则选用凝胶柱。第二是洗脱方式，可先用等度洗脱方式进行尝试。在等度洗脱不能奏效情况下，再采用梯度洗脱方式，梯度洗脱的重现性上有一定要求，可以通过固定仪器(低压混合或高压混合)、色谱柱、简化溶剂系统，尽量简化梯度条件、恒定测定温度等方式得到有效控制，可利用系统适应性实验和方法学来规范操作过程。第三是检测器，HPLC法建立指纹图谱可据物质情况选择紫外(UV)、二极管阵列检测器(DAD)、蒸发光散射或折光等方式。采用DAD可进行测定波长的优化选择，检测峰纯度和对化学成分的溯源等工作。 本论文采用正交设计法，以葛根素和葛根总黄酮为指标，对提取工艺进行系统综合评价，并对试验结果进行统计分析，最后确定最佳工艺条件是加9倍量30％乙醇提取3次，每次1h。提高了原料的利用率(提取率)，提取的黄酮比较完全，有利于指纹图谱的研究。通过对影响大孔树脂吸附及解吸葛根总黄酮各种因素的系统研究，最后确定了大孔树脂分离的最佳工艺为：树脂型号为日本三菱公司的SP70型大孔树脂，药液浓度为0.5g/mL(相当于原生药)，药液pH为5～6，吸附速率为2BV/h时吸附效果最好，上柱量为60倍树脂床体积。洗脱最佳工艺为5倍树脂床体积的70％乙醇以2BV/h的速率洗脱效果最佳。经SP70处理后的葛根总黄酮可达80％以上，这种料液或做成的浸膏可应用于生产实际。通过12 批次野葛药材样品各色谱峰的相对保留时间和峰面积百分比的比较和分析，对共有指纹峰进行了确定，并据此成功建立了野葛药材的HPLC 指纹图谱。经与不同产地野葛样品和粉葛样品的HPLC 图谱的比较，结果表明，实验获得的色谱指纹图谱在不同产地野葛样品中具有极大的相似性，并能据此与粉葛品种进行有效的区分；从而可以有效反映野葛药材成分特征的唯一性和同一物种个体间的相似性，可以作为野葛药材专属性的指纹图谱。 在柴胡的指纹图谱研究中，能较好地柴胡的种类进行鉴定以及质量评价。以北柴胡的特征指纹和相对峰面积均值为比较标准，由于北柴胡与柴胡属药材在总差异率方面有明显的不同，北柴胡有18个不同产地的样品，但它们的总差异率在0.367～0.865之间。除北柴胡外，在柴胡属植物的6个样品中有5个的总差异率超过此值，占样品总数的83％。因此特征指纹的总差异率可作为考察的首要条件，区分与鉴定北柴胡与柴胡属中其他品种药材。 柴胡属植物中有21号(阿尔泰柴胡)、24号(泸西柴胡)、2号(北柴胡)、20号(银州柴胡)4个样品，它们的总差异率均低于0.600。其中2号经鉴定是北柴胡，属正常情况，21号和24号两者的特征指纹检出率均为70％，该值低于拟定的特征指纹检出率界线76％，即可排除在北柴胡品种之外。20号样品的的特征指纹检出率为80％，高于上述界线，它的10强峰有9个都被收入特征指纹峰之列。以上各项参数均说明20号样品与北柴胡极相似，从色谱指纹谱的角度而言，20号银州柴胡有可能被纳入药用。当然，要达到此目的尚需做大量的药理、药效、毒理等实验，以保证临床用药安全有效。 通过对黄芪指纹图谱研究的方法进行了稳定性、精密度和重复性考察，建立了黄芪药材HPLC指纹图谱，以参照物峰的保留时间和峰面积分别计算共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，不同批次黄芪的相对保留时间RSD小于1.0％，而相对峰面积的RSD较大。由此可知，本实验建立的色谱方法可以使不同批次黄芪药材具有基本一致的色谱行为，但药材之间各种化学成分(活性组分)的含量受多种因素的影响具有较大差异。