家蚕食物选择行为的生理学比较及味觉受体基因BmGr8的功能研究

摘要

植食性昆虫中，食性是决定它们与何种植物建立关系或相互作用的一个主导因素，昆虫的食性反映某种昆虫在自然情况下的食物性质和来源。按照植食性昆虫取食植物种类的多寡，可将植食性昆虫划分为单食性昆虫、寡食性昆虫和广食性昆虫。昆虫利用化学感受神经系统(包括嗅觉和味觉)中的反馈信息对趋性反应、觅食、取食行为进行指导。鳞翅目昆虫种类和数量庞大，其中大部分是农田害虫，因此对鳞翅目昆虫嗅觉、味觉感受系统的研究尤为重要。家蚕是鳞翅目昆虫的模式生物，也是最先完成全基因组测序的鳞翅目昆虫。家蚕觅食和取食行为过程中涉及到的行为学、感受系统形态学、电生理学，以及神经感受系统中化学感受受体基因的全基因组分析、鉴定与功能等研究已经取得了丰硕的成果。但总体而言，有关家蚕食性的分子基础仍知之甚少。本研究比较了家蚕幼虫寻找及选择食物的生理学行为；同时比较了寡食性家蚕和广食性棉铃虫五龄幼虫对取食忌避物的识别能力差异：并从味觉电生理角度分析了它们味觉感受器的神经细胞对植物中取食刺激物及取食忌避物(有毒或苦味物质)的敏感性差异。本研究基于家蚕9×基因组数据库和染色体图谱，系统分析了家蚕基因组中编码的化学感受受体(包括嗅觉受体和味觉受体)基因家族。进一步综合应用免疫组化、真核表达、β-半乳糖苷酶融合表达等技术对味觉受体基因BmGr8和BmGr53的功能和跨膜拓扑结构进行了探讨。本文报道的结果，不仅在理论上为研究其它昆虫的化学感受受体基因的功能提供了重要参考，也为研究家蚕食性形成和昆虫与植物相互关系提供理论基础，在应用上亦使得化学感受受体基因成为鳞翅目农业害虫防治的分子靶标，从而使开发新一代的生物农药成为了可能。
　　 本研究获得的主要结果如下：
　　 1.家蚕觅食及取食行为分析
　　 昆虫嗅觉识别挥发性气味的能力可指导昆虫的行为反应。本研究利用自行设计的四臂嗅觉仪分析了家蚕幼虫在宿主与非宿主植物诱导下产生的行为趋向反应。实验选取的宿主植物为桑叶(桑科)，非宿主植物为青蒿(菊科)和樟树叶(樟科)。实验结果表明，蚁蚕、二龄起蚕和三龄起蚕在同时受到桑叶(汁)、青蒿叶(汁)和樟树叶(汁)引诱时，大多数幼虫选择非宿主植物青蒿叶(汁)和樟树叶(汁)。实验结果说明了家蚕嗅觉感受系统能帮助家蚕判断食物源的方向，但所寻得的食物并非是它的宿主或取食偏好植物。本研究中，幼蚕不取食对它们引诱力强的青蒿或者樟树叶，反而持续取食引诱力弱的桑叶，表明味觉感受系统对植物成分的识别在家蚕食物选择过程中起主要作用。本研究中，取食含有青蒿叶粉(或青蒿素)的人工饲料时，蚁蚕的死亡率增加。取食桑叶以外的菊科植物莴苣叶和油麦菜叶，二龄幼蚕有明显中毒现象，且龄期延长。结果表明，除了味觉系统对取食植物成分的识别作用外，消化系统对取食植物的反馈作用以及植物中营养成分是否能够满足家蚕生长发育要求等因素，对家蚕食物选择及寡食性的形成也有重要作用。
　　 2.寡食性家蚕与广食性棉铃虫识别食物中苦昧物质能力的差异性比较
　　 昆虫味觉系统对食物中忌避物质的识别有明显的行为学表现。本研究比较了五龄眠起家蚕和棉铃虫在接触含有植物忌避次生代谢物(水杨苷和咖啡因)的人工饲料时的初始反应，以及24小时供食后，幼虫的取食状况。结果表明，广食性棉铃虫对食物中水杨苷的敏感性低于寡食性家蚕，但棉铃虫对咖啡因的识别能力强于家蚕。
　　 3.寡食性家蚕与广食性棉铃虫味觉感受器形态学及昧党电生理研究
　　 植食性鳞翅目昆虫味觉感受系统对植物中次生代谢物的取食刺激物和忌避物的识别，在昆虫食物选择过程中起主要作用。虽然家蚕和棉铃虫下颚瘤状体上栓锥形感受器类型和感受器内部的神经细胞数量相同，但对植物成分识别程度不同。本研究比较了寡食性家蚕和广食性棉铃虫对蔗糖、肌醇两种取食刺激物和水杨苷、咖啡因两种取食忌避物的识别差异，以及相关敏感神经细胞在两类栓锥形感受器中的分布情况。实验结果表明，家蚕和棉铃虫侧栓锥形感受器内均含有1个蔗糖敏感细胞。家蚕肌醇敏感细胞存在于侧栓锥形感受器内，而棉铃虫肌醇敏感细胞则存在于中栓锥形感受器内。低至10-3mM的myo-肌醇和10-5mM的蔗糖即可引起家蚕和棉铃虫味觉神经细胞强烈的电生理反应。随着肌醇和蔗糖浓度的增大，神经细胞对二者的识别频率逐渐增大，但是棉铃虫神经细胞对肌醇和蔗糖的识别频率始终高于家蚕。味觉神经细胞对取食忌避物的识别实验结果表明，家蚕中栓锥形感受器内有一个可同时识别水杨苷和咖啡因的神经细胞，而在棉铃虫的栓锥形感受器中，没有发现能够稳定识别咖啡因和水杨苷敏感的神经细胞。不同食性鳞翅目昆虫下颚瘤状体上味觉神经细胞在栓锥形感受器中的数量和空间排布有差异，相同功能的神经细胞数量也有差异。这些差异在一定程度上加剧了昆虫食性的分化，是昆虫与植物协同进化的结果。
　　 4.家蚕味觉受体基因家族的鉴定
　　 本研究基于家蚕9倍基因组数据库、预测的蛋白质数据库和已知的昆虫味觉受体氨基酸序列，共鉴定得到69个家蚕味觉受体基因序列。结合已知的家蚕66个嗅觉受体基因序列，分析家蚕135个化学感受受体基因在染色体上的分布。结果表明家蚕135化学感受受体基因遍布23条染色体，其中大部分基因串联排列于染色体的同一区域。推测这些基因可能具有同一个祖先基因，在特定条件下发生了基因重复事件。在昆虫味觉受体系统发育分析中，家蚕味觉受体中BmGN-10与BmGr63属于糖受体家族。家蚕的BmGr1-3与昆虫二氧化碳受体同源体聚为保守的一支，推测其可能具有保守的识别二氧化碳的功能。家蚕味觉受体中有58个苦味味觉受体聚为单系发生支，这些基因可能起源于相同的一个祖先基因，通过基因复制、基因扩张成为物种特异的基因群。
　　 5.家蚕糖受体BmGr8体外功能研究
　　 为了鉴定家蚕糖受体BmGr8的体外识别功能，本研究从家蚕下颚瘤状体cDNA中克隆得到BmGr8基因，并将BmGr8异源表达到鳞翅目昆虫细胞Sf9细胞系中，进行钙成像和细胞内钙离子浓度检测(Calcium imaging)。实验结果表明，异源表达的家蚕糖受体蛋白BmGr8在体外不能识别蔗糖等7种糖类物质、scyllo-肌醇和allo-肌醇，但能识别myo-肌醇及epi-肌醇，且随刺激物浓度的增加而增加。家蚕味觉受体BmGr8仅识别高浓度epi-肌醇，而识别myo-肌醇的浓度低至2mM，略高于新鲜桑叶中myo-肌醇浓度1.6mM。该受体是第一个鉴定得到的昆虫肌醇受体。
　　 6.家蚕糖受体BmGr8及苦昧受体BmGr53拓扑结构研究
　　 哺乳动物化学感受受体具有G-蛋白偶联受体(GPCR)受体典型的结构特征：胞外的N末端、胞内的C末端以及七次跨膜结构域。根据相似的氨基酸序列和跨膜结构域特征，从昆虫基因组中鉴定出昆虫化学感受受体，但随后的实验证实大多数昆虫化学感受受体不具备GPCR受体家族特点。用不同的跨膜结构域算法对家蚕味觉受体蛋白跨膜结构域进行预测，结果表明同一味觉受体的跨膜结构域的插入位置和数量有所不同。为了研究味觉受体跨膜拓扑结构，本实验选取家蚕肌醇受体BmGr8和苦味受体BmGr53作为研究家蚕味觉受体跨膜结构域数量及插入位置的靶受体。本研究利用细胞免疫荧光实验、共聚焦显微镜技术及β-半乳糖苷酶融合技术，在鳞翅目昆虫Sf9细胞系及双翅目昆虫果蝇S2细胞系中，成功鉴定了异源表达的家蚕味觉受体BmGr8和BmGr53具有胞内N末端、胞外C末端和奇数次跨膜结构域的结构特征。这种结构与果蝇嗅觉受体跨膜拓扑结构相同，而与典型的GPCR结构相反。这是首次对昆虫味觉受体拓扑结构进行探索，为进一步研究受体功能、结合位点等奠定了基础。