超声预处理影响金枪鱼皮胶原ACE抑制肽释放机制及其酶解液消化稳定性的研究

摘要

金枪鱼是一种重要的经济鱼类，在全世界有很高的渔获量，因口感细腻、营养丰富深受消费者的喜爱。金枪鱼加工过程往往会产生占总重50~70％左右的下脚料，这些下脚料一般加工为饲料或鱼饵，经济价值不高，还会造成一定的环境污染。金枪鱼皮含有丰富的胶原蛋白，三螺旋区域富含Pro和Hyp，是制备ACE抑制肽的良好来源。但胶原蛋白的三螺旋结构非常稳定，除金属基质蛋白酶外，其他蛋白酶很难接触到胶原蛋白核心部位并释放多肽，通常需要对原料进行适当的预处理以松散三螺旋结构，暴露出内部酶切位点，促进三螺旋区活性肽段的释放。传统的预处理方式为酸、碱处理，但操作复杂且污染严重，超声作为一种绿色能源可用于原料预处理。本文主要研究超声预处理对金枪鱼皮胶原ACE抑制肽释放的影响机制，并对水解液胃肠消化特性以及其中高ACE抑制活性多肽的一级结构进行研究。
　　以金枪鱼皮为原料，酶解液的DH和Hyp含量为指标，对胶原蛋白三螺旋区肽段释放的超声预处理工艺进行优化，结果表明超声时间为20 min、超声功率为30%（195 W）、料液比为1：15时为最优预处理条件，该条件下酶解液DH为14.89%， Hyp含量为0.046 g。与未处理组相比，超声处理组DH和Hyp含量有显著提高（P＜0.05），表明超声预处理促进了酶解过程的进行，同时促进了胶原三螺旋区多肽的释放。通过FTIR分析比较超声预处理前后的金枪鱼皮结构，结果表明超声破坏了胶原蛋白构象，从而促进了胶原三螺旋区多肽的释放，促进了酶解过程的进行。通过HPLC分析两组酶解液中10 kDa以下小分子多肽分布情况，结果表明超声预处理组小分子含量为88.67%，未处理组为46.39%，说明超声预处理组酶解液中含有大量来源于三螺旋区的小分子肽段。
　　为明确超声预处理对金枪鱼皮酶解过程ACE抑制肽释放的影响，对不同预处理条件下酶解过程中酶解液的DH、ACE抑制率及分子量分布进行测定，并通过DSC和FTIR分析超声预处理前后金枪鱼皮胶原蛋白热稳定性及胶原蛋白结构变化。酶解过程酶解液DH、ACE抑制率测定结果表明，超声预处理对鱼皮胶原蛋白结构有一定的破坏作用，可改变酶解模式，在酶解5min时，酶解液DH与未处理组有显著差异（P＜0.05），且ACE抑制率均高于未处理组，说明超声可促进短时酶解过程中胶原三螺旋区ACE抑制肽的快速释放。SDS-PAGE、HPLC分析组分分子量变化情况的结果表明，随着酶解的进行，10 kDa以上大分子组分含量呈往复增减的变化规律，超声预处理可加速这一过程的进行，从而提高ACE抑制肽的释放效率。DSC结果表明，1~20 min的超声预处理可导致鱼皮胶原热变性温度降低，与5 min酶解后，对应酶解液具有高ACE抑制率的结果一致，说明1~20 min的超声预处理一定程度上破坏了胶原构象，可提高ACE抑制肽的释放效率；但40 min的超声预处理导致鱼皮热变性温度升高，可能是因为长时间的超声处理促使大量组分溶出并快速被降解，未溶出的胶原主体稳定性反而得到加强，造成热稳定性有所增加。FTIR结果表明，超声预处理破坏了胶原蛋白内部与N-H相关的氢键平衡，减少了维持三螺旋构象的分子间和分子内缔结氢键，减少蛋白结构中与C=O相关的氢键作用，进而松散了胶原三螺旋结构，同时造成胶原中α螺旋、β折叠含量减少，无规则卷曲、β转角含量增加，使胶原结构向无序化转变。这些变化可使更多的三螺旋区酶切位点暴露，在酶解过程中可以促进ACE抑制肽的快速释放。
　　为验证酶解液是否可在体内发挥ACE抑制活性，通过体外模拟消化实验研究胃肠消化对酶解液ACE抑制活性的影响。结果表明各组消化液经过肠胃模拟消化后ACE抑制活性均有所提高，且其中含有大量分子量低于3 kDa的小分子多肽，易于被小肠上皮细胞吸收，并发挥其ACE抑制活性功效；其中超声预处理20min和40 min组的5 min酶解液效果最为明显，选取以上两组酶解液对其中高ACE抑制活性多肽进行进一步分离鉴定。首先用E5U20的样品对SephadexG-15分离样品的条件进行筛选，结果表明层析柱为1 m×10 mm，洗脱速度为0.5 mL/min，洗脱剂为蒸馏水的洗脱条件较好，两组样品均可分离为三个组分，其中E5U20组组分2的IC50值最小为0.393 mg/mL，将该组分进一步用RP-HPLC进行纯化，得到8个组分，其中峰3的 IC50值最小为0.102 mg/mL，通过质谱法测定序列为GPSGPPGP，分子量为665 Da，IC50值为153.31μmol/L，是来源于α1肽链第842~849位，符合高ACE抑制活性的多肽构效特点，目前尚无该氨基酸序列的报道。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 金枪鱼

1.2 ACE抑制肽

1.3 胶原ACE抑制肽的研究

1.4 研究目的与意义

1.5 研究内容

1.6工艺路线

第二章 基于三螺旋区肽段释放的超声预处理工艺优化

2.1材料与仪器

2.2实验方法

2.3结果与分析

2.4 本章小结

第三章 超声预处理对酶解过程ACE抑制肽释放的影响及释放机制研究

3.1 实验材料与仪器

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

第四章 ACE抑制肽体外模拟消化及消化产物的分离纯化、鉴定

4.1 材料与仪器

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文及参加课题