近江牡蛎糖胺聚糖免疫调节作用及体外抗肿瘤活性的研究

摘要

目的：
　　本文以近江牡蛎全脏器为实验原料，通过酶解法提取近江牡蛎糖胺聚糖(Crassostrea Rivularis glycosaminoglycan)，对其理化性质和免疫调节作用、体外抗肿瘤活性进行研究。
　　方法：
　　采用柱层析法分离纯化近江牡蛎糖胺聚糖得到纯化级分；用高效液相色谱(HPLC)法、红外光谱(IR)法分析其理化性质；采用小鼠体内注射环磷酰胺(CTX)法建立免疫抑制动物模型以及细胞实验，分析近江牡蛎糖胺聚糖对小鼠的非特异性免疫、细胞免疫、体液免疫和NK细胞活性的影响；采用ELISA法检测肿瘤坏死因子TNF-α、干扰素IFN-γ，、小鼠白细胞介素IL-2的含量；同时测定近江牡蛎糖胺聚糖体外对K562、CNE-2Z、Hela细胞生长的影响。
　　结果：
　　1.对酶解法提取得到的近江牡蛎糖胺聚糖粗提物(PCG)进行等电点除蛋白和超滤脱盐浓缩，得到精制品(CG)，经DEAE-52纤维素柱分离得到组分CGⅠ和CGⅡ。对CGⅠ和CGⅡ分别过Sephadex G-200凝胶柱，得到组分CGⅠa和CGⅡa。经分析，CGⅠa是由糖醛酸：氨基葡萄糖=1:1.38的比例构成，硫酸基含量为20.62％，相对分子量5.17×105Da；CGⅡa，是由糖醛酸：氨基葡萄糖=1:1.58的比例构成，硫酸基含量为18.49％，相对分子量为2.64×105Da。红外光谱分析显示，CGⅠa和CGⅡa都具有糖胺聚糖的特征吸收，CGⅡa具有α糖苷键。
　　2.近江牡蛎糖胺聚糖对免疫功能的调节作用结果：
　　(1)对小鼠免疫器官的影响：在体外免疫抑制模型中，50 mg/kg和100 mg/kg的CG可以显著增强正常小鼠的脾指数和胸腺指数(P<0.05，P<0.01)；并对CTX造成的免疫抑制小鼠的脾指数和胸腺指数具有修复作用，效果显著(P<0.05，P<0.01)。
　　(2)对小鼠细胞免疫的影响：CG，CGⅠa，CGⅡa(10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)均能促进和协同ConA促进小鼠脾淋巴细胞的增值，其中25μg/ml的CGⅠa剂量组的刺激系数最高，达到1.44。CG、CGⅠa和CGⅡa协同ConA刺激脾淋巴细胞的增值效果体现出了与CG、CGⅠa、CGⅡa直接作用于脾淋巴细胞的增持效果相同的趋势，其相关性较强。
　　(3)对小鼠单核巨噬细胞的影响：CGⅠa和CGⅡa(10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)均能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力(P<0.05或P<0.01)；25mg/kg和50 mg/kg剂量的CG对小鼠廓清指数有显著增强作用(P<0.05)。
　　(4)对小鼠抗体生成细胞数和血清溶血素的影响：CG(25 mg/kg，50 mg/kg，100 mg/kg)抗体生成数与生理盐水对照组均有极显著差异(P<0.01)，对CTX模型组的治疗效果极其显著(P<0.001)；CG(50 mg/kg，100mg/kg)的小鼠血清溶血素含量与生理盐水对照组有极显著差异(P<0.01)，CG(25 mg/kg，50 mg/kg，100 mg/kg)能够提高CTX模型组的血清溶血素水平(P<0.05或P<0.01)。
　　(5)对NK细胞的影响：CG、CGⅠa、CGⅡa的四个剂量组(10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)均能增强NK细胞的杀伤活性(P<0.05或P<0.01)，存在一定的量效关系。100μg/mL的CGⅠa杀伤活性最高，达到39.09％。
　　(6)细胞因子实验结果：CGⅠa和CGⅡa(251μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)均能促进小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α和NO(P<0.05或P<0.01)；CGⅠa和CGⅡa(25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)能够促进小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子IL-2(P<0.05或P<0.01)和IFN-γ(P<0.01)；TNF-α、IFN-γ、IL-2的最大产生量分别为912.941 pg/mg，651.579 pg/mg，2.821pg/mg。
　　3.体外肿瘤抑制实验：CG，CGⅠa和CGⅡa(10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL)对K562、CNE-2Z、Hela细胞的生长均具有抑制作用，与5-Fu合用可以增敏抗肿瘤药效。
　　结论：
　　(1)近江牡蛎糖胺聚糖的纯化级分CGⅠa和CGⅡa的相对分子量分别为5.17×105Da和2.64×105Da，经化学法分析和红外光谱分析都是糖胺聚糖。
　　(2)近江牡蛎糖胺聚糖对正常小鼠免疫器官指数、细胞免疫的影响、单核巨噬细胞影响、抗体生成数和血清溶血素影响、NK细胞的杀伤活性均为阳性，表明其具有免疫增强功能。免疫功能的增强可能是通过促进细胞因子的分泌实现的。
　　(3)近江牡蛎糖胺聚糖在体外直接作用于肿瘤细胞K562、CNE-2Z和Hela，一定程度地抑制其生长，并能够与5-Fu联用来增强抑制肿瘤细胞生长的效果；根据近江牡蛎糖胺聚糖对体外培养肿瘤细胞的作用结果并结合3.4.2.1实验结果初步判断，近江牡蛎糖胺聚糖能够直接作用于肿瘤细胞，而对正常细胞无杀伤作用。