肿瘤细胞核移植的重新编程和核型变化研究

摘要

肿瘤目前是对人类生命最大的威胁，对肿瘤的发生机制做了大量的研究工作，但仍没有公认的能完全阐明的理论。肿瘤的细胞学特征包括以下五个方面：持续分裂增殖、去分化、逃避凋亡、转移及血管生成。针对这几个表型特征的抑制及逆转治疗都显示了一定的应用前景，但仍然没有找到可以完全逆转肿瘤的方法。对于肿瘤逆转的可能性及可能的机制研究是肿瘤治疗的一个新视点和锲机。2004年RudolfJaenisch将小鼠畸胎瘤细胞作为供核细胞得到核移植囊胚，提取内细胞团注入正常囊胚，最后得到嵌合体小鼠，显示了通过核移植手段逆转肿瘤细胞的可能性和可行性。 核移植(nucleartransfer或nucleartransplantation)是指用显微操作的方法，将供核细胞的核移入去核的卵母细胞或早期合子内，激活后核受体胞质对供体核重新编程(reprogramming)，形成核移植重组胚。1997年二月Nature发表了Wilmut等的文章，即将一成年母羊乳腺细胞作为供核细胞构建重组胚，再植入养母子宫得到了Dolly羊。这是人类首次用体细胞核移植技术得到的哺乳类克隆动物，遗传性质同供给体细胞的动物完全一致。 发育成熟的体细胞和肿瘤细胞核移植后发育的过程牵涉到对移入的细胞核的重新编程。移植的细胞核重新编程是否充分是决定核移植重组卵能否继续发育及发育程度的重要因素。J.Gurdon曾将蝌蚪肠上皮的细胞核移植到去核的受精卵中，核移植重组胚不久后便终止发育，并且有相当的细胞核出现了非整倍的染色体组型。J.Gurdon又进一步选取其中有健康核型的细胞作为供核细胞，将其细胞核再次移植到去核卵母细胞中，这时7％的重组胚发育为成体。RudolfJaenisch将小鼠畸胎瘤细胞作为供核细胞进行核移植也只能得到囊胚，不能进一步发育，提取核移植囊胚的内细胞团注入正常囊胚，才能得到嵌合体小鼠。这说明伴随发育的进行，细胞核的功能状态发生了某种变化，只有能“恢复”到合适状态的细胞核，才能实现核移植重组胚的正常发育。 本实验在现有的核移植技术基础上对核移植各操作过程及胚胎培养条件进行摸索与改进，提高并稳定核移植效率：1)用添加3％蔗糖的培养液短时间处理MⅡ期卵母细胞证实能实现小鼠MⅡ期卵母细胞核的可视化，使得去核效率达100％，并且减少去核过程中的胞质损失，利于重组胚进一步发育。2)对比电脉冲、电脉冲+CHX、酒精+CHX、Sr2++CCB、Sr2++CHX+CCB五种重组胚激活方法的激活效果，发现各处理方式激活率和囊胚形成率有差异，Sr2++CHX+CCB激活效果最好。3)对比血清饥饿处理不同时间对供核细胞B16细胞的损害和周期同步效果以及相应的核移植效率，发现血清饥饿处理3-5天的B16细胞作为供核细胞效果最好。4)对比几种不同参数的脉冲电波的电融合效果及相应的重组胚发育效率，发现脉冲电压及脉冲时程在一定范围内调整对融合效果没有明显影响，电压过低过高或脉冲时程超出范围对电融合不利。 将各个发育时期的体细胞核移植胚胎、肿瘤细胞核移植胚胎及孤雌激活胚胎这三组植入前胚胎的卵裂球进行彗星试验检测，经软件分析各组细胞的彗星试验图像，对比这三组胚胎细胞的核型，观察重新编程过程对这三组胚胎细胞核的影响，发现肿瘤细胞核移植重组胚细胞相对于其它几组细胞的核型有以下异常：1、肿瘤细胞核移植胚胎细胞M期卵裂球彗星试验图像积分光密度分布较弥散，说明染色体异倍体比例很高。2、肿瘤细胞核移植胚2细胞期到8细胞期卵裂球行彗星试验可见彗尾，2细胞期尾DNA百分含量最大，到4、8细胞期逐渐减小，至桑椹胚期彗尾消失。其它几组卵裂球彗星试验只有极少量可见彗星尾。可能是因为肿瘤细胞核移植重新编程过程伴随染色体重塑造，这个过程的异常导致染色体断裂或暴露出碱性环境下不稳定部位。

目录

第一章核移植操作方法及胚胎培养条件的进一步优化

前言

材料

实验方法

实验结果

讨论

第二章肿瘤细胞核移植构建重组胚及核型变化检测

前言

材料

实验方法

实验结果

讨论

全文小结

参考文献

附录：攻读硕士学位期间发表文章

致谢

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