胚胎干细胞重新编程肿瘤细胞的研究

摘要

胚胎干细胞是来自于囊胚内细胞团的多能性细胞。近年来研究者发现,胚胎干细胞可以通过细胞融合改变成体细胞的表观遗传学特性。在对小鼠的研究中发现,当胚胎干细胞和成体神经细胞、T淋巴细胞或成纤维细胞等融合之后,所得到的杂合细胞(4N)具有和胚胎干细胞类似的特性,如融合细胞可以体外分化和自我更新、将其移植入小鼠皮下可以产生畸胎瘤及进行囊胚注射之后融合细胞可以参入胚胎发育。在表观遗传学方面,表现为分化细胞上某些特异性表达基因的去甲基化、失活的X小体重新活化、多能性基因上组蛋白H3K4重新甲基化,以及H3K27和H3K9的去甲基化等。也有研究结果显示,胚胎干细胞中的某些多能性基因如Nanog,OCT4,SOX2及维持胚胎干细胞特性的某些肿瘤基因如Klf4及C-MYC在重新编程过程中起重要的作用。 我们设想胚胎干细胞也许同样或者在某种程度上具有重新编程肿瘤细胞的能力。在以往的核移植重新编程试验中,虽然卵母细胞可以对某些肿瘤细胞,如畸胎瘤细胞、黑色素瘤细胞和脑肿瘤细胞进行某种程度的重编程,但是所得到的细胞仍具有肿瘤源性,部分原因归咎于卵母细胞核移植的自身特性。已有的研究结果表明,相对于核移植,胚胎干细胞通过细胞融合所得到的杂合细胞可以在更大程度上消除体细胞自身记忆,而且在技术上容易操作。然而,至今为止仍未有人研究胚胎干细胞是否可以通过细胞融合来改变肿瘤细胞的表观遗传学特性。 我们建立了胚胎干细胞和肿瘤细胞融合的方法和条件,并且对融合细胞进行分析。我们选择了两种分化程度不同的肿瘤细胞作为本研究的起始实验材料,即小鼠畸胎瘤细胞P19和小鼠成体肿瘤细胞Hepal-6。两种细胞的区别在于分化的程度以及随着肿瘤细胞的分化程度不同,其肿瘤抑制基因启动子部位DNA超甲基化状态和组蛋白甲基化水平也相应的产生不同程度的差异。 通过与胚胎干细胞融合,肿瘤细胞被重新编程,体现在：1)杂合细胞在细胞形态和增殖水平上与胚胎干细胞相似,而与融合母体肿瘤细胞有显著差异。其中ESxP19具有和胚胎干细胞相似的克隆样表型,而ES×Hepa1-6有三种表型。两株杂合细胞的生长速度和胚胎干细胞相类似；2)通过融合,胚胎干细胞可以改变肿瘤细胞和成体细胞的基因表达方式。在成体肿瘤细胞和胸腺细胞中,组织来源的特异性基因表达消失,多能性基因重新表达；在胚胎来源的畸胎瘤细胞中,多能性基因的表达明显上升；3)通过与胚胎干细胞融合,重新编程的成体肿瘤中失活的某些肿瘤抑制基因得以重新表达,而异常活化的一些原癌基因表达下调；4)重新编程后的成体细胞具有和胚胎干细胞相似的体内体外分化潜能。重新编程后的肿瘤细胞可以在体外形成拟胚体,在体外分化中,和胚胎干细胞相似可以分化到三个胚层；5)被重新编程的肿瘤细胞并没有完全的丧失肿瘤源性,表现在组织中成熟细胞所占比例比胚胎干细胞形成的成熟细胞比例低,未成熟组织占到整个组织切片的70％以上。组织切片可见明显的癌巢组织和未成熟的恶性细胞类型。我们认为,胚胎干细胞不能完全对肿瘤细胞进行重新编程,所得到的杂合细胞是-种具有和胚胎干细胞相类似的可以无限增殖和自我分化的畸胎瘤细胞。这种结果可能归咎于肿瘤细胞的某种特殊表观遗传学调控方式,如抑制性组蛋白H3K9me3和H3K27me2不影响基因表达,但可以使染色质仍处于密集的异染色质状态。在某些诱导条件下这些负性调控机制会募集DNA转甲基化酶使DNA重新甲基化,使肿瘤抑制基因重新被抑制,原癌基因重新表达。我们推测,在胚胎干细胞与肿瘤细胞的杂合细胞中,这些控制染色体结构的表观遗传学调控因子阻碍了胚胎干细胞所启动的重新编程。而这些表观遗传学调控因子在未来可能成为治疗肿瘤的潜在靶点。 本研究的创新点在于：1、首次发现通过与胚胎肝细胞融合,不同分化程度的肿瘤细胞均可以被重新编程,体现在分化程度和基因表达水平的改变；2、首次发现胚胎干细胞不能通过细胞融合完全改变肿瘤细胞的肿瘤源性,其原因可能在于肿瘤细胞内在的某些特性限制了肿瘤细胞被重新编程的程度。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

前言

一、体内发生的细胞融合

二、体外发生的细胞融合

三．肿瘤细胞的重新编程

四．本课题的研究内容和拟解决的问题

实验材料

一、主要器材和设备

二、主要试剂及其制备

三、实验动物

实验方法

一、Hygromycin-RFP质粒的制备

二、病毒包装及转染

三、细胞培养

四、慢病毒转染胚胎干细胞

五、瞬转PEGFPC1于肿瘤细胞Hepa1-6及P19，稳定建系

六、细胞融合

七、细胞染色体标本的制备

八、流式细胞仪检测细胞的DNA含量

九、细胞计数

十、细胞生长曲线的测定

十一、克隆形成实验

十二、细胞的致瘤性

十三、石蜡包埋和切片

十四、细胞免疫化学

十五、RT-PCR

十六、Q-PCR分析基因相对表达量

实验结果

一、建立稳定的融合前转基因细胞株

二、融合后的杂合细胞

讨论

一、融合系统的选择

二、分化程度不同的肿瘤细胞在与胚胎干细胞融合后出现的差别及可能性分析

三、杂合细胞的多能性基因、组织特异性基因和肿瘤相关基因的表达

四、杂合细胞的分化潜能和肿瘤源性

五、胚胎干细胞和肿瘤细胞融合所得到的杂合细胞是畸胎瘤细胞

附录 Hygromycin-RFP质粒图谱

参考文献

Cell fusion：from in-vivo to in-vitro

致谢