瓜类蚜传黄化病毒的检测和侵染性克隆构建

摘要

瓜类蚜传黄化病毒（Cucurbit aphid-borneyellows virus，CABYV）属于黄症病毒科(Luteoviridae)，马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）。该病毒在欧洲和亚洲的主要瓜类种植区均有报道发生，流行范围广，大面积发生时造成严重的减产。目前CABYV已在我国多个省市发生，对西甜瓜等重要经济作物的安全生产造成极大的威胁。
　　为了了解该病毒在我国的发生情况，我们对新疆鄯善、甘肃瓜洲和河南通许地区的瓜类作物进行了取样调查。采用双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)法对常见的病毒进行病毒检测，以期了解这三个地区的西瓜甜瓜病毒种类及分布，为当地西瓜和甜瓜病毒病的防控提供参考。结果表明:小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellow mosaic virus，ZYMV)的检出率最高，为31.3％，其次为瓜类蚜传黄化病毒（Cucurbit aphid-borneyellows virus，CABYV）和西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV），检出率分别为26.9％、26.1％，黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaicvirus，CMV）和甜瓜蚜传黄化病毒（Melon aphid-borneyellows virus，MABYV）的检出率较低，分别为14.2％、8.2％，而南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus，SqMV）和番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papaya ring spot virus-watermelon strain，PRSV-W)未检出，河南和新疆发现MABYV尚属首次。
　　经过RT-PCR检测，发现这3个瓜类产区均有CABYV发生。通过扩增CABYV基因组的部分片段，我们获得了1.4kb的序列，包括3'端的部分依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)基因、非编码区(NCR)和全长外壳蛋白(CP)基因。通过对序列进行分析，发现分离物的CP基因与GenBank中的序列进行比对，其序列相似性为93.2％-100％。通许分离物间序列相似性为97.6％-99.9％，瓜州分离物间序列相似性为97.4％-100％，鄯善分离物间序列相似性为97.9％-100％,组内表现出极高的同源性;基于其部分RdRp基因、NCR及CP基因序列构建的系统进化树表明:25个CABYV分离物与中国及周边地区（泰国、韩国等）的分离物聚为一簇，而与欧洲地区分离物距离较远，说明了该病毒分子变异与分离物的地理分布有关。
　　同时，在前期工作中，我们通过设计引物克隆全长CP基因，并插入原核表达载体BL21(DE3)，但在IPTG诱导下，无法表达蛋白。通过对CP基因进行分析，优化了5'端序列，将抑制原核表达的位点进行突变，重新合成5'端280bp的序列，将此优化后的序列替换掉之前的序列，得到优化后的重组质粒。使用1mmol/L的IPTG37℃诱导4h，能得到40k Da大小的蛋白，与预期一致。
　　侵染性克隆是病毒基因功能及其他研究的基础。通过RT-PCR将CABYV全长基因组分为2段进行扩增，然后利用无缝克隆技术(In-Fusion)插入双元表达载体pXT1，转入农杆菌GV3101，构建农杆菌介导的侵染性克隆。浸润接种本生烟28天后通过RT-PCR及Northern-Blot能在系统叶中检测到CABYV基因组及亚基因组，接种40天能观察到典型的黄化症状，与CABYV的田间症状相似，表明其已具备对本生烟的侵染活性。

目录

声明

摘要

1．1 瓜类病毒的发生概况

1．2 瓜类蚜传黄化病毒的研究进展

1．2．1 CABYV的分子生物学特性

1．2．2 症状及分布

1．2．3 寄主范围、传播介体及传播方式

1．2．4 CABYV株系分化

1．3 CABYV的检测技术

1．3．1 生物学检测

1．3．2 血清学检测

1．3．3 分子生物学方法

1．4 防治策略

1．4．1 控制病毒传播介体昆虫

1．4．2 利用寄主植物的抗病性

1．4．3 交互保护作用

1．5 单克隆抗体在病毒检测中的应用

1．6 研究目的及意义

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 样品采集

2．2．2 主要试剂

2．2．3 病毒样品的DAS-ELISA检测

2．2．4 病毒样品的RT-PCR检测

2．3 结果与分析

2．3．2 对黄化型疑似病毒病样的RT-PCR检测结果

2．3．3 检测结果汇总

2．4 讨论

第三章 新疆、甘肃和河南瓜类蚜传黄化病毒分子多样性分析

3．1 前言

3．2．1 病毒样品采集

3．2．2 菌株和质粒

3．2．4 试验仪器和设备

3．3 试验方法

3．3．1 总RNA提取

3．3．2 RT-PCR扩增

3．3．3 PCR产物胶回收及连接载体

3．3．4 感受态细胞制备

3．3．5 重组质粒转化大肠杆菌感受态

3．3．6 重组质粒的鉴定

3．3．7 序列分析

3．4 结果与分析

3．4．1 CABYV分离物序列扩增与克隆

3．4．2 CABYV部分片段的序列分析

3．5 讨论

第四章 瓜类蚜传黄化病毒CP基因突变及原核表达

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 质粒及菌株

4．2．2 主要的分子试剂

4．2．4 质粒双酶切

4．2．5 目的片段回收

4．2．6 连接转化

4．2．7 质粒提取及转化

4．2．8 突变CP基因的诱导表达与分析

4．3 结果与分析

4．3．1 CP基因突变及重组质粒构建

4．3．2 突变CP基因的诱导

4．4 讨论

第五章 CABYV侵染性克隆的构建及侵染本生烟

5．1 引言

5．2．3 分子试剂

5．2．4 引物

5．2．5 仪器设备

5．3 方法

5．3．1 总RNA的提取

5．3．2 反转录

5．3．4 PCR产物电泳及回收

5．3．5 质粒提取及双酶切

5．3．6 片段连接载体及转化大肠杆菌

5．3．7 阳性克隆鉴定及测序

5．3．8 质粒提取及转化农杆菌

5．3．9 GV3101农杆菌浸润接种本生烟

5．3．10 侵染性检测

5．4 结果与分析

5．4．2 PXT1质粒提取及酶切鉴定

5．4．3 阳性克隆测序结果

5．4．4 农杆菌浸润接种本生烟的检测

5．4．5 农杆菌浸润接种本生烟的症状表现

5．5 讨论

第六章 全文总结

参考文献

致谢

作者简历