北方部分省市番茄黄化曲叶病毒的检测鉴定及辣椒分离物侵染性克隆构建

摘要

番茄黄化曲叶病毒病（Tomatoyellowleafcurlvirusdisease）是番茄生产中的一种毁灭性病害。番茄黄化曲叶病毒病于2006年在上海、江苏和浙江等省蔬菜种植区相继被发现，随后从南方各省迅速扩展至北方的山东、河南、河北、北京、内蒙古等地的保护地蔬菜种植区，在番茄生产上造成了严重的经济损失。随着PCR技术、血清学检测、滚环扩增等技术的发展，人们对番茄黄化曲叶病毒病有了一定的认识，并采取了相关措施减少经济损失。为了更好的了解番茄黄化曲叶病毒病的发生区域、寄主范围及其变异方向等，我们于2011年至2012年对中国北方河南、山东、河北、天津、吉林、内蒙古等省份进行了番茄黄化曲叶病毒病的调查，采集样品扩增全序列，对其分析。主要研究结果如下:
　　1.通过双生病毒通用引物对样品进行PCR检测，选取阳性样品使用番茄黄化曲叶病毒特异引物扩增全长并测定序列。利用软件处理序列后发现，获得的序列全长为2781个核苷酸，DNA-A共编码6个开放阅读框，病毒链编码2个开放阅读框，编码AV1(CP)和AV2，反义互补链有4个开放阅读框，编码AC1（Rep）、AC2、AC3和AC4，以及开放阅读框AV2和AC1之间(对应核苷酸2617-147nt)的一个长313nt非编码的基因共同区(intergenicregion，IR)。
　　2.选取GenBank中全国各个地区的番茄黄化曲叶病毒分离物进行相似性比对，结果表明所测得序列与以色列株系Tomatoyellowleafcurlvirus-Israel(TYLCV-IL)相似性最高，为97.2％～98.3％。进化树表明，我国北方大部分地区的番茄黄化曲叶病毒分离物属于Tomatoyellowleafcurlvirus-Israel，并且分为3个亚组。对山东、河南、河北省TYLCV序列分析，发现TYLCV在这三个省处于一种平衡状态，基因交流频繁。
　　3.在山东省辣椒植株中发现番茄黄化曲叶病毒，为了分析其对辣椒、番茄等作物的致病性，采用基因克隆方法，构建侵染性克隆pCAMBIA0380-1.4A。用含有pCAMBIA0380-1.4A的农杆菌接种本生烟、番茄，接种30天后表现出明显的皱缩、曲叶等症状，并利用番茄黄化曲叶病毒特异引物对这些病株进行PCR检测，结果表明，从表现皱缩、曲叶症状的病叶组织总DNA中均能扩增到800bp的特异片段，表明本研究所构建的TYLCV辣椒分离物侵染性克隆具有侵染性。接种辣椒，21天后辣椒未表现出黄化曲叶典型症状，但取叶片通过PCR扩增检测出TYLCV，证明辣椒被侵染成功。

目录

声明

论文说明

英文缩略表

摘要

1 前言

1．1 双生病毒的概况

1．1．1 双生病毒的结构特征

1．1．2 双生病毒的分类

1．2 双生病毒的侵染过程

1．2．1 双生病毒的复制

1．2．2 双生病毒的转录

1．2．3 双生病毒的移动

1．3 番茄黄化曲叶病毒

1．3．1 番茄黄化曲叶病毒分类及特征

1．3．2 番茄黄化曲叶病毒病的发生情况

1．3．3 田间寄主范围

1．3．4 番茄黄化曲叶病毒病害的生物学特性

1．3．5 番茄黄化曲叶病毒的接种

1．3．6 番茄黄化曲叶病毒的检测

1．4 番茄黄化曲叶病毒的防治

1．5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 病毒样品的采集和植物材料

2．1．2 菌株和载体

2．1．3 酶与各种生化试剂

2．1．4 实验所需试剂及配制

2．1．5 主要实验仪器

2．1．6 寡核苷酸引物及合成

2．2 实验方法

2．2．1 毒源病株PCR检测

2．2．2 番茄黄化曲叶病毒分离物基因扩增、序列测定及分析

2．2．3 TYLCV辣椒分离物侵染性克隆的构建

3 结果与分析

3．1 TYLCV分离物基因组扩增结果

3．1．1 TYLCV分离物的PCR检测

3．1．2 TYLCV分离物全长的扩增及序列测定

3．2 TYLCV分离物全长序列分析

3．2．1 TYLCV分离物序列核苷酸相似性分析

3．2．2 系统进化树分析

3．2．3 遗传多样性分析

3．2．4 重组分析

3．2．5 种群统计分析

3．3 TYLCV-LJ侵染性克隆构建结果

3．3．1 TYLCV-LJ-1．4A的构建

3．3．2 侵染性克隆接种番茄、本生烟、辣椒的结果

4 结论与讨论

4．1 TYLCV吉林和辽宁省分离物的鉴定

4．2 北方番茄黄化曲叶病毒分布、变异分析

4．3 番茄黄化曲叶病毒寄主范围调查

4．4 TYLCV-LJ侵染性克隆的构建

参考文献

致谢