瓜类褪绿黄化病毒侵染性载体的构建方法

摘要

本发明涉及一种瓜类褪绿黄化病毒侵染性载体的构建方法。以瓜类褪绿黄化病毒为材料对基因组RNA1和RNA2进行了侵染性克隆的构建，将8.6KbRNA1和8KbRNA2分别构建在高效的植物表达载体pCB301M上，重组载体通过氯化钙转化的方法转入农杆菌菌株，获得以农杆菌介导的对寄主植物具有高效侵染能力的病毒载体。本发明为研究病毒基因组结构与功能及其与寄主之间的互作研究、为外源蛋白的表达和植物基因组功能研究提供了成熟的方法和体系。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种瓜类褪绿黄化病毒侵染性载体构建方法。

背景技术

瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV）属于长线形病毒科（Closteroviridae），毛形病毒属（Crinivirus），病毒粒子为线状，长度介于650-900 nm之间，基因组由两条正义单链RNA构成，分别为RNA1及RAN2，RNA1基因组约8.6 Kb，编码4个开放阅读框，分别是甲基转移酶（MTR）、RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）、P6和P22，RNA2基因组约8 Kb，编码8个开放阅读框，其中热击蛋白同系物(Hsp70h)、P59、外壳蛋白(CP)、重复的外壳蛋白(CPm)以及P26在属内是相对保守的。就如毛形病毒属的其它病毒一样，CCYV是一种维管束传播病毒，不能通过机械摩擦接种，极大地限制了该病毒基因功能的研究。目前毛形病毒属关于CP蛋白的研究较少，有研究发现，番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus, TCV）的CP蛋白通过马铃薯X病毒（Potato virus X, PVX）异源表达能够发挥沉默抑制子效应，与CPm和P22共同组成多组分沉默抑制子。

侵染性全长cDNA克隆是研究RNA病毒的重要工具。侵染性克隆有助于研究病毒的复制、胞间移动和长距离运输、症状的形成以及病毒和寄主因子的互作。此外，侵染性克隆可以改造成合适的载体用于在特定的寄主上进行异源基因的表达或病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing， VIGS）目前有两种方式可以获得全长侵染性RNA，一种是通过SP6、T3或T7启动子体外转录获得，另一种是通过花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus, CaMV）35S启动子体内转录获得，后者比前者花费少且更实用。目前接种侵染性克隆的方法主要是包括摩擦接种、农杆菌浸润接种和基因枪接种。对于存在于韧皮部的病毒，机械摩擦接种不能侵染寄主，而基因枪接种成本高，操作复杂，因此农杆菌浸润接种作为一种经济可行的方法被广泛应用于局限于韧皮部的植物病毒的接种，主要包括黄症病毒科、双联病毒科和长线形病毒科的病毒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种瓜类褪绿黄化病毒侵染性载体的构建方法。本发明是以粉虱传瓜类褪绿黄化病毒为材料来建立侵染性载体构建的方法。

本发明的技术方案是：

（1）从感染瓜类褪绿黄化病毒的发病株中提取植物基因组提取总RNA；

（2）以植物总RNA为模板，分别设计瓜类褪绿黄化病毒基因组的两个组分RNA1和RNA2的两对引物，

组分RNA1的引物序列如下：

RNA1F1F：5‘-GGAAATCAACACTCCTTCGT-3’，

RNA1F1R： 5‘-GTAGAGGAAAGTGCACGTG-3’；

RNA1F2F：5‘- TATTCTTAGCCACGTGCACT-3’，

RNA1F2R：5‘-  GGCCTAGCTATACTAATAAC -3’；

组分RNA2的引物序列如下：

RNA2F1F：5‘-  GGAAATTATCCACGGTTTC-3’，

RNA2F1R： 5‘- CATACGTGCACTTATCAAC -3’；

RNA2F2F：5‘- GGTTGATAAGTGCACGTATG-3’，

RNA2F2R：5‘- GGCCTAGCTATGCTACTAAC -3’；

涵盖病毒RNA2全长，进行反转录PCR扩增；

（3）利用限制性酶切的方法将RNA1的两个片段依次构建到改良型植物表达载体pCB301M上，获得带有RNA1全长基因组的重组植物表达载体，并将其导入到大肠杆菌；利用限制性酶切的方法将RNA2的两个片段构建到改良型植物表达载体pCB301M上，获得带有RNA1全长基因组的重组植物表达载体，并将其导入到大肠杆菌；

（4）通过氯化钙转化法将带有RNA1的重组表达载体和带有RNA2的重组表达载体导入具有较强感染能力的农杆菌菌株GV3101，构建得到瓜类褪绿黄化病毒侵染性载体。

所述步骤（3）中设计pCB301的引物：

pCB301F： 5‘-GTGCACTCTAGAGGATCCCCG-3’

pCB301R： 5‘-CTGAATTCCGATCTAGTAAC-3’

以pCB301为模板，以pCB301F与pCB301R为引物，扩增pCB301得到300 bp片段，连接到pMD19-T载体，得到pMD19TF1，SalI和EcoRI双酶切pMD19TF1，切胶回收片段连接到同样双酶切的pCB301载体，得到重组载体pCB301M；

以反转录的cDNA为模板，以RNA1F1F与RNA1F1R为引物，PCR扩增获得3880 bp片段，PCR产物通过ApaLI酶切，插入到StuI和ApaLI双酶切的pCB301M载体上，得到重组载体pCB301RNA1F1，以RNA1F2F与RNA1F2R为引物，PCR扩增获得4736 bp片段，PCR产物通过ApaLI酶切，插入到SmaI和ApaLI双酶切的pCB301RNA1F1载体上，得到重组载体pCB301RNA1；

以反转录的cDNA为模板，以RNA2F1F与RNA2F1R为引物，PCR扩增获得2517 bp片段，PCR产物通过ApaLI酶切，插入到StuI和ApaLI双酶切的pCB301M载体上，得到重组载体pCB301RNA2F1，以RNA2F2F与RNA2F2R为引物，PCR扩增获得5543 bp片段，PCR产物通过ApaLI酶切，插入到SmaI和ApaLI双酶切的pCB301RNA2F1载体上，得到重组载体pCB301RNA2。

本发明的优点：

（1）传统的植物表达载体基因组较大，而CCYV的RNA1和RNA2基因组都超过8 Kb，使用传统的载体构建难度大，稳定性差，本发明使用改良的植物表达载体pCB301M，载体基因组小，并且含有强35S启动子，复制量大大加强，在这个载体上可以直接进行简单方便的操作。

（2）本发明使用农杆菌介导的方式，是一种比较高效且简单实用的方法，可以适用于韧皮部传播的病毒的接种。

（3）本发明使用的方法可以对构建的载体进行植物内源基因cDNA片段的插入，从而进行植物功能基因组的研究。

（4）本发明使用的方法可以对构建的载体插入外源基因，研究特定的基因功能。

具体实施方式

本发明以瓜类褪绿黄化病毒为材料进行侵染性载体的构建，瓜类褪绿黄化病毒基因组有两个组分，分别是RNA1和RNA2。本发明通过将RNA1的两个片段和RNA2的两个片段依次构建到植物表达载体pCB301M上，通过农杆菌浸润的方法使病毒基因组进入植物细胞并开始自行复制，从而实现病毒对植物的高效感染。

2012年6月，河南省郑州市蔬菜所温室大棚摘取黄瓜叶。

瓜类褪绿黄化病毒RNA1和RNA2侵染性载体的构建

a 植物总RNA的提取

（1）在本实验室保存的黄瓜病株上取0.1 g新鲜的叶片，加液氮研磨成粉末状，移入一灭菌的1.5 ml离心管中，然后加入1 ml的Tri-Reagent，剧烈振荡摇匀或将1 ml的Tri-Reagent加入到-80 ^oC冻存的1×10⁶ 原生质体中，剧烈振荡3 min；冰上放置5 min；

（2）匀浆用IEC台式冷冻离心机于4^oC、12,000g条件下离心10 min以除去不溶的成分，将上清转入一新的1.5 ml离心管中；

（3）在室温下静置5 min，加0.2 ml 氯仿，剧烈震荡15 sec，然后在室温下静置 2–5 min，再于4 ^oC、12,000 × g的条件下离心15 min；

（4）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加0.5 ml异丙醇，混合(上下颠倒)，使样品在室温下静置15 min，4^oC、12,000 × g离心10 min，则RNA会在管的侧壁和底部形成沉淀；

（5）弃上清，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4^oC、7,500 × g离心5 min（如RNA沉淀悬浮起来，则用12,000 × g），弃乙醇；

（6）RNA在室温下干燥10 min或在冷冻离心浓缩机上浓缩5 min，加入30μl DEPC处理的超纯水溶解沉淀，-70 ^oC保存备用。

b 反转录反应 

以提取的植物总RNA为模板，以RNA1F2R和RNA2F2R作为反向引物，进行反转录反应。反应体系如下：

在反应管中依次加入以下样品或试剂：dNTPs (10 mM) 1.0 μl，引物 (20 μM) 1.0 μl，Total RNA (0.5μg/μl) 1.0 μl，RNase free H₂O 11.0 μl，反应管在65℃反应5 min，冰上至少放置1 min。然后依次加入以下试剂：5× Reverse Transcription Buffer 4.0 μl，RNase inhibitor (40 unites/μl) 1.0 μl，M-MLV Reverse Transcriptase (200 U/μl) 1.0 μl，RNase free Sterile H₂O 11.0 μl，在42^oC反应1 h，70^oC灭活M-MLV Reverse Transcriptase（Promega）。

c 侵染性克隆的构建

以pCB301为模板，以pCB301F (5‘-GTGCACTCTAGAGGATCCCCG-3’)与pCB301R(5‘- CTGAATTCCGATCTAGTAAC-3’)为引物，扩增pCB301约300 bp片段，连接到pMD19-T载体，得到pMD19TF1，SalI和EcoRI双酶切pMD19TF1，切胶回收片段连接到同样双酶切的pCB301载体，得到重组载体pCB301M。

以反转录的cDNA为模板，以RNA1F1F（ 5‘-GGAAATCAACACTCCTTCGT-3’）与RNA1F1R ( 5‘-GTAGAGGAAAGTGCACGTG-3’)为引物，PCR扩增获得3880 bp片段，PCR产物通过ApaLI酶切，插入到StuI和ApaLI双酶切的pCB301M载体上，得到重组载体pCB301RNA1F1，以RNA1F2F（5‘- TATTCTTAGCCACGTGCACT-3’）与RNA1F2R（5‘-  GGCCTAGCTATACTAATAAC -3’）为引物，PCR扩增获得4736 bp片段，PCR产物通过ApaLI酶切，插入到SmaI和ApaLI双酶切的pCB301RNA1F1载体上，得到重组载体pCB301RNA1。

以反转录的cDNA为模板，以RNA2F1F（ 5‘- GGAAATTATCCACGGTTTC -3’）与RNA2F1R ( 5‘- CATACGTGCACTTATCAAC -3’)为引物，PCR扩增获得2517 bp片段，PCR产物通过ApaLI酶切，插入到StuI和ApaLI双酶切的pCB301M载体上，得到重组载体pCB301RNA2F1，以RNA2F2F（5‘- GGTTGATAAGTGCACGTATG -3’）与RNA2F2R（5‘-  GGCCTAGCTATGCTACTAAC-3’）为引物，PCR扩增获得5543 bp片段，PCR产物通过ApaLI酶切，插入到SmaI和ApaLI双酶切的pCB301RNA2F1载体上，得到重组载体pCB301RNA2。

重组载体对农杆菌的转化

植物表达载体的转化是通过氯化钙转化法进入农杆菌宿主细胞，取200 μl感受态细胞，加入1 μg重组载体，液氮中速冻1 min，37^oC水浴5 min，加入1 ml LB，28^oC慢速振荡培养4－6 h后，涂布于含有含50 μg/mlKm和10 μg/ml四环素的LB固体培养基平板上，28^oC培养约48 h。挑取平板上长出的单菌落，接种于LB液体培养基（含有50 μg/ml Kan和10 μg/ml 四环素）中，28℃振荡培养过夜，碱裂解法小量提取质粒DNA，进行PCR鉴定。

农杆菌注射接种

上述2种带有RNA1和RNA2的重组植物表达载体的农杆菌接种10 ml含有卡那霉素（50 μg/ml）和四环素（10 μg/ml）的LB液体培养基，28 ℃ 220 rpm摇菌培养至OD600为08-1.2；经10000 rpm离心 2 min，弃上清，用含10 mM MgCl2，10 mM MES，100 μM乙酰丁香酮的浸润缓冲液中重新悬浮菌体，调整OD600为1.0，等量混合两种农杆菌菌液，静置2-3 小时后浸润植物备用，选用4-6片真叶的苗龄期的植株，利用不带针头的1 ml注射器在植物叶片背面进行浸润，一株植物浸润2-3片叶；接种植物置于25 ℃隔离温室培养。

瓜类褪绿黄化病毒侵染性克隆的侵染性测定

接种20～30 天后观察接种植株的症状。接种的黄瓜在接种后30 天下部叶片出现典型的黄化症状，接种的本氏烟叶片没有观察到明显的症状，采取系统叶片进行RT-PCR检测，发现接种的本氏烟和黄瓜都能检测到瓜类褪绿黄化病毒的侵染，将扩增的特异性片段进行测序分析进一步证实了检测的特异性。

表1 瓜类褪绿黄化病毒对不同植物的侵染性及侵染效率检测

在黄瓜中的接种率为92.9%，在本氏烟中的接种率为88.2%（表1）。

<110> 河南农业大学

 

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