父本基因组在小鼠卵母细胞中的主动去甲基化研究

摘要

受精后小鼠卵子中父本基因组的主动去甲基化对于植入前的胚胎发育是非常重要的。然而植入前胚胎主动去甲基化的机制仍不甚明了，DNA去甲基化酶是否确实存在于MⅡ卵母细胞胞质中还是源自母本基因组也未有确切结论。 为判定MⅡ卵的胞质还是母本基因组对于父本基因组的主动去甲基化起作用，我们将冻融的精子头注射到正常或去核的MⅡ卵中，然后研究了其中父本基因组的甲基化状态。我们通过5-甲基胞嘧啶免疫染色的方法比较了单倍体和二倍体孤雄胚胎(通过注射一个或两个精子头到去核的MⅡ卵)、ICSI(introcytoplasmicsperminjection)胚胎、三倍体胚胎(注射两个精子头到完整MⅡ卵)以及原核移植生产的重构孤雄胚胎。结果显示所有实验组的胚胎都能发生父本基因组的主动去甲基化。 我们还使用bisulfite测序的方法检测了原核期和囊胚期持家基因和印迹基因CpG位点的甲基化变化，来比较植入前孤雄胚胎发育中两种基因的甲基化模式。我们收集了双精注射和原核移植生产的二倍体孤雄胚胎受精后8h的原核和随后发育而成的囊胚，对于持家基因α-actin以及印迹基因H19和Igf2之间的ICR(imprintingcontrolregion)的甲基化水平进行了分析。通过bisulfite处理后测序，结果显示精子中处于完全甲基化状态的α-actin基因在受精后所有CpG位点都完全去甲基化了，并且可能维持这种状态至囊胚期。相反，ICR在孤雄胚胎原核期和囊胚期的甲基化水平都只是稍有降低。我们的结果说明了父本基因组中的持家基因在原核期会被完全去甲基化，而一些印迹基因则不能进行主动去甲基化。印迹基因甲基化被保留的原因或许取决于它在父本表达还是母本表达。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章引言

第二章父本基因组在小鼠卵母细胞中的主动去甲基化免疫检测

第三章孤雄胚胎去甲基化水平的分子检测

第四章讨论

参考文献

缩略语表(Abbreviations)

致 谢

作者简历