本论文包括三部分研究内容。第一部分，猪体外成熟卵母细胞孤雌激活或ICSI后，比较不同激活方案对激活或ICSI胚胎体外发育能力的影响，以优化ICSI后的激活方案。第二部分，在第一部分研究基础上，将还原型谷胱甘肽连同精子一同注射入卵母细胞质内，研究外源谷胱甘肽对ICSI胚胎体外发育能力的影响。第三部分，进一步比较不同精子处理方法对ICSI胚胎体外发育能力的影响，以优化ICSI技术体系。研究结果如下： 第一部分研究不同激活方案对猪ICSI胚胎发育能力的影响。实验1比较电激活后间隔不同时间用化学物质处理对猪孤雌激活胚胎发育能力的影响。研究结果表明卵母细胞电激活后随着时间的延长，第二极体排出率逐渐升高，卵母细胞激活后间隔3h和4h，大部分卵母细胞均排出第二极体(60.94％和78.95％)，与其它两组差异显著(P<0.05)。间隔不同时间，卵裂率和囊胚细胞数均无显著差异(P>0.05)，但是随着间隔时间的延长，囊胚率显著降低。间隔3h后囊胚率为34.36％，间隔4h后为21.11％，差异显著(P<0.05)，间隔0h和间隔2h囊胚率无显著差异(P>0.05)；通过对囊胚进行核型分析，结果显示间隔0h和间隔2h，50％以上的囊胚均为二倍体，第二极体没有排出，差异不显著(P>0.05)。间隔3h后，孤雌胚单倍体比例显著升高，间隔4h后几乎全部囊胚均为单倍体，差异显著(P<0.05)。实验2比较电激活后间隔不同时间用化学物质处理对猪ICSI胚胎体外发育能力的影响。结果表明：①电激活后间隔0h与间隔4h ICSI胚胎激活率差异显著(59.09％vs 87.23％)(P<0.05)，间隔3h ICSI胚胎激活率与其他两组无显著差异(P>0.05)。②电激活后间隔4h再用DMAP处理，ICSI胚胎卵裂率显著低于其他两组的卵裂率(56.53％vs89.49％和79.58％)(P<0.05)。⑨间隔不同时间ICSI胚胎的囊胚率与囊胚细胞数虽无显著差异(P>0.05)，但间隔3h后ICSI胚胎的囊胚率仍略高于其他两组，因此以下的实验中我们均采用IGI胚胎电激活后间隔3h再用DMAP处理作为激活方案。实验3比较不同激活方案对猪ICSI胚胎体外发育能力的影响。结果表明ICSI胚胎电激活后间隔3h再用DMAP或U0126处理6h受精率、卵裂率及囊胚率均无显著差异(P>0.05)。用U0126处理6h较用U0126处理4h可以显著提高受精率(P<0.05)，用U0126处理6h与处理8h正常受精率无显著差异(P>0.05)，三组间卵裂率及囊胚率均无显著差异，但处理6h组较其它两组稍高；因此ICSI胚胎较好的激活方案为电激活后间隔3h再用DMAP或U0126处理6h。 第二部分研究将精子连同谷胱甘肽一同注射入猪体外成熟卵母细胞对胚胎发育能力的影响。结果表明将谷胱甘肽连同精子一同注入与单独注射精子相比，卵母细胞激活率无显著差异(81.54％vs 85.71％，P>0.05)，且形成2个极体2个原核比例也无显著差异(47.69％vs 41.43％， P>0.05)。卵裂率与囊胚细胞数均无显著差异(85.72％vs 90.26％，47.46 vs 48.01，P>0.05)，但囊胚率差异显著(16.58％ vs 29.10％，P<0.05)，注入谷胱甘肽后显著降低囊胚发育率。对囊胚进行核型分析，结果显示两者间二倍体和单倍体形成比例均无显著差异(P>0.05)，有70％的囊胚为正常二倍体。说明将还原型谷胱甘肽注射入卵母细胞质不能提高ICSI胚胎的发育能力。 第三部分研究不同精子处理方法对ICSI胚胎体外发育能力的影响。①精子用不同化学药物处理后经流式细胞仪检测，结果表明精子用不同化学药物处理后各组间aT的平均值均存在显著差异(250.9±2.3、229.1±5.4、597.7±7.7、263.2±4.4和578.3±9.0，P<0.05)。随着aT值升高，COMPaT值也升高，精子用DTr或DTr+肝素处理后SD aT值(176.5±2.4和180.1±7.0 vs 84.3±11.0、85.1±9.3、88.2±8.7，P<0.05)和COMP aT 值均显著高于其他三组(29.5±0.6和36.2±10.9 vs 3.7±0.6、7.0±0.8、12.2±2.4，P<0.05)。其他三组间SD aT值和COMP aT值均无显著差异(P>0.05)。对照组、GSH组和GSH+肝素组绿色荧光分布的平均值显著低于其他两组(481.7±25.5、470.8±5.0和537.8±5.4 vs 645.9±8.5、849.8±78.1，P<0.05)，DTT组和DTr+肝素组绿色荧光分布的平均值也存在显著差异(P<0.05)。②精子用不同化学药物处理后ICSI胚胎后期发育能力研究结果表明各组间激活率无显著差异(P>0.05)，但正常受精率差异显著，精子用GSH孵育120min组形成2个极体2个原核的比例显著高于对照组及用DTT处理组(62％ vs 33.33％和38.78％，P<0.05)，与肝素+谷胱甘肽处理组和肝素+DTT处理组无显著差异(P>0.05)。ICSI胚胎卵裂率无显著差异(P>0.05)，囊胚发育率存在显著差异，用谷胱甘肽处理组囊胚发育率显著高于对照组、DTT组和肝素+DTT组(40.21％ vs 19.60％、25.96％、28％，P<0.05)，与肝素+谷胱甘肽组无显著差异(40.21％ vs 32.26％，P>0.05)。肝素+谷胱甘肽组囊胚发育率显著高于对照组(32.26％ vs 19.60％，P<0.05)，而与其他组无显著差异(P>0.05)，DTT组与对照组囊胚率无显著差异(25.96％ vs19.60％，P>0.05)。肝素+DTT组囊胚细胞数显著高于其他四组(54.05 vs 44.71、38.96、42.32、38.92，P<0.05)，其他组间囊胚细胞数无显著差异(P>0.05)。对受精卵进行染色体分析，结果表明尽管各组间无显著差异(P>0.05)，但DTT处理组以及肝素+DTT组染色体损伤程度较对照组和谷胱甘肽处理组高，染色体均出现小片段或大片段的损伤，而对照组、谷胱甘肽处理组以及肝素+谷胱甘肽处理组染色体损伤程度均比较小。对囊胚进行核型分析，结果显示DTT处理组所形成囊胚大部分均为单倍体，而其他组所形成囊胚大部分为正常二倍体囊胚，存在显著差异(P<0.05)。各组间均没有多倍体囊胚形成。
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