高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中三聚氰胺

摘要

应用高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中三聚氰胺。样本先用1％三氯乙酸(10％二甲亚砜)提取，再加甲醇沉淀蛋白质，高速离心后，过膜供液相色谱-串联质谱仪定性定量分析。三聚氰胺是弱碱性化合物，不溶水，微溶于甲醇，乙醇，溶于1％三氯乙酸(10％二甲亚砜)。奶粉中蛋白质含量高，用水(0.1％甲酸)-乙醇(体积比1：1)作为提取溶剂，沉淀的蛋白质会包埋三聚氰胺，导致提取率低;用1％三氯乙酸作为提取溶剂，强阳离子交换柱净化，色谱保留时间4.60min，样本基质仍干扰测定。 本研究工作先用3m11％三氯乙酸(10％二甲亚砜)超声提取奶粉中三聚氰胺，再加7ml甲醇沉淀蛋白质，既保证较高的提取率，又能充分沉淀蛋白质。在进行样本分析时，三聚氰胺出峰时间9min左右，与基质基本分离，并采用基质标准工作液来校正最终结果，确保了分析的准确性：质谱切换阀将三聚氰胺出峰时刻4min时间段的流动相切入质谱，其余时间切入废液，减少了离子源的污染，分析大量样本后质谱喷雾口和传输毛细管仍然保持清洁。NH2柱分离，流动相为V(甲醇)：V(水)=98：2混合溶液。三聚氰胺中含有多个碱性官能团，在一级质谱扫描中监测到不同电荷的分子离子。分别用纯水，0.1％的甲酸，10mM乙酸铵，甲醇和乙腈等五种常见流动相将标准储备液稀释至1mg/L，以1μl/min的流速流动注射，选择离子监测(SIM)三聚氰胺单电荷分子离子[M+H]+(m/z=127)，双电荷分子离子[M4-2H]2+(m/z=64)和三电荷分子离子[M+3H]3+(m/z=43)，扣除各自溶剂空白。结果发现，三聚氰胺在有机相(甲醇，乙腈)中单电荷分子离子响应信号远远高于水相(水，甲酸溶液和乙酸铵溶液);水相中三聚氰胺双电荷电离高于单电荷电离，而有机相中主要是单电荷电离。小分子质谱分析为提高分析的准确度和灵敏度，常选择单电荷分子离子进行分析。三聚氰胺在C18和C8柱上保留时间很短，和基质共流出，影响离子化效率，为了增强保留，通常加大水相比例，并添入缓冲剂甲酸和乙酸铵或离子对试剂辛烷磺酸钠和TFHA。上述研究表明，水相比例大会降低质谱灵敏度。本研究选择对强极性官能团有很好保留的Waters Spherisorb(R) NH2色谱柱进行分离，获得了理想的保留时间，减少了基质干扰;以甲醇和纯水(98：2)作为流动相等度洗脱，不仅获得了满意的峰形，而且保证了质谱分析的灵敏度。采用电喷雾离子源，正离子方式，选择反应监测(SRM)模式，定性离子对为127/85和127/68;定量离子对为127/85。分辨率Q1=0.7FWHM，Q3=0.7FWHM，喷雾电压(Spray voltage)4000V，夹套气(Sheath gas，N2)压力25psi，毛细管加热温度350°C，辅助气(Aux gas，N2)压力5u，离子吹扫气(Ion sweep gas，N2)压力Ou，源内CID电压0V，其它条件见表1;7min～11min流动相切入质谱，其余时间段切入废液瓶。 三聚氰胺中含有多个强极性官能团-伯胺，选择电喷雾电离(ESI)源，通过三通接口，让流动相把流动注射1mg/L的三聚氰胺标准溶液带入质谱系统，在正离子模式下得到三聚氰胺的分子离子峰。对分子离子[M+H]+(m/z=127)的透镜补偿电压，喷雾电压，夹套气压力，辅助气压力，离子吹扫气压力，毛细管加热温度和源内CID电压等质谱参数优化，使三聚氰胺分子离子的灵敏度达到最大时定为最佳质谱条件。然后在碰撞池中引入1.5mTorr氩气，优化碰撞能量，使子离子灵敏度达到最大，优化后定性离子对为127/85和127/68,相对丰度比为100:20，定量离子对为127/85。 本研究采用源内CID与串接四极杆质谱连动的办法，进行多级碎片(n>2)分析，为分析分子离子裂解机理和推测碎片结构式提供了更多的信息。源内CID电压设为0V，一级质谱扫描的分子离子[M+H]+，在碰撞池20eV的能量作用下裂解产生碎片，二级质谱扫描监测到质荷比为110，85，68和60的离子;源内CID电压设为-10V，分子离子在进入一级质谱前碎裂，一级质谱扫描到质荷比为110的离子在10eV的碰撞能量作用下碎裂产生质荷比为82，68的离子，二级质谱监测到这些离子的信号，由此可见质荷比为68的离子可由质荷比为110的离子裂解得到：源内CID电压设为-10V，一级质谱扫描到质荷比为85的离子在10eV的碰撞能量作用下也产生质荷比为68的离子，质荷比为85和68的离子也有子代关系。根据上述分子离子与碎片以及碎片之间代谢关系，可推断质荷比为110，85，68和60的离子结构式分别为[M+H-NH3]+，[M+H-H2NCN]+，[M+H-NH3-H2NCN]+,[M+H-HN(CN)2]+。在添加了5μg/kg～500μg/kg的三聚氰胺标准品时的回收率为86％～97％：相对标准偏差(RSD)为3.1％～6.2％：检出限为1μg/kg。先用三氯乙酸提取三聚氰胺，再加甲醇沉淀蛋白质，避免包埋，提高了提取效率;利用NH2柱，样本中三聚氰胺在98％甲醇流动相中与基质较好分离，减少了干扰，提高了灵敏度。样本实测表明，该方法适合目前国内外奶粉中三聚氰胺的监控和检测。