自剪切及活性相关位点的组合突变提高CPC酰化酶水解活力

摘要

头孢菌素C(Cephalosporin C,CPC)是继青霉素之后的世界上第二大类β-内酰胺抗生素,而7-氨基头孢烷酸(7-ACA)作为头孢菌素类抗生素的关键中间体,在医药工业中具有重要价值.一般通过化学法或生物酶法脱去CPC的侧链而得到.因为生物酶法在利用CPC生产7-ACA中具有反应条件温和和对环境友好等优点,所以生物酶法开始成为工业生产的新方向.本文以来源于Pseudomonas sp KAC-1的CA(属于1类)蛋白序列为模版，对CA进行全局优化设计，人工合成得到目标基因并克隆至表达载体pET28b并实现了CAD的高效表达。通过SDS-PAGE分析可知表达的CA剪切不彻底，仍有一部分以前体形式存在，而自剪切的效率会影响CA的表达活性，因此对影响自剪切与活性的相关位点进行突变分析。通过结构分析，选择几个与ca活性和自剪切相关的位点进行饱和突变，发现这些位点氨基酸的替换可影响一次剪切和二次剪切。通过这些位点进行组合突变，最终得到了比活力提高了8.3倍的突变体CPCase-tib。