头孢菌素酰化酶高β-折叠区保守氨基酸附近位点突变研究

摘要

头孢菌素酰化酶(Cephalosporin acylase)能够一步催化头孢菌素C(Cephalosporin C,简称CPC)生成7-氨基头孢烷酸(7-Aminocephalosporanic acid,简称7-ACA),后者是重要的医药中间体.但头孢菌素酰化酶对CPC的一步催化活性低,远未达到工业生产的要求.研究以来源于Pseudomonas sp.SE83头孢菌素酰化酶(CPCase)蛋白序列为模板,对其基因进行全局优化设计,人工合成目的 基因,并克隆至表达载体pET28a,实现了CPCase的高效表达,命名为WT.将其与来自Pseudomonas SY-77、Pseudomonas N176等菌株的头孢菌素酰化酶氨基酸序列进行相似性比较,在保守氨基酸附近选择了25个突变位点,采用定点突变的方法分别突变为Ala,获得了25个突变酶.结果 表明,突变体蛋白F311A对CPC的催化活性上升50％,kcat/Km提高到原来的1.7倍,比酶活达到4.302 U/mg,其他突变体对CPC催化活性均有不同程度的下降.结构分析显示,第311的Phe突变为Ala,能够使结合口袋变大,减少空间位阻,使酶与底物CPC的结合更加牢固,提高催化效率.