一种百合地黄汤中化学成分的检测方法及指纹图谱的建立方法

摘要

本发明涉及药物分析技术领域，尤其是涉及一种百合地黄汤中化学成分的检测方法及指纹图谱的建立方法，包括：将百合地黄汤前处理得到待测液；采用高效液相色谱法对待测液进行检测，得到百合地黄汤中化学成分的色谱图；将所述色谱图与指纹图谱采用相似度评价系统进行匹配，得到百合地黄汤中化学成分的含量；色谱参数为：柱温：25℃～32℃；检测器波长：330nm和/或210nm；色谱柱：C18 4.6*250mm，5μm或2.1*50mm，1.7μm；流动相流速为0.8～1.2mL/min；所述流动相为梯度洗脱；流动相A：乙腈溶液；流动相B：0.1％的磷酸溶液。本发明结果准确、可靠，具有良好的重现性和稳定性。

说明书

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，尤其是涉及一种百合地黄汤中化学成分的检测方法及指纹图谱的建立方法。

背景技术

百合地黄汤，中医方剂名，出自《金匮要略》，为养阴清热剂。具有养阴清热，补益心肺之功效。是百合病之心肺阴虚内热证的常用方剂。症见神志恍惚，意欲饮食复不能食，时而欲食，时而恶食；沉默寡言，欲卧不能卧，欲行不能行，如有神灵；如寒无寒，如热无热，口苦，小便赤，舌红少苔，脉微细。

中药指纹图谱是目前中药产品质量控制主要手段之一，可更全面的反映中药产品整体特征。目前指纹图谱研究常用高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法等，其中高效液相色谱法方法重复性好、准确性高，便于推广与执行。

现有技术公开了采用液相色谱和轨道肼高分辨质谱进行成分测定，但是其分离度不佳，造成了指纹图检测结果不准确，不利于百合地黄汤产品质量的控制。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种百合地黄汤中化学成分的检测方法，本发明的方法结果准确，分离度佳，稳定性良好。

与现有技术相比，本发明一方面提供了一种百合地黄汤中化学成分的检测方法，包括以下步骤：

S1、将百合地黄汤过滤或采用溶剂溶解，得到待测液；

S2、取百合地黄汤中至少一个化学成分的标准品，分别配置得到相应浓度的参照物，混合得到参照物对照品溶液；

S3、采用高效液相色谱法，在相同的检测条件下分别获得步骤S1中所述待测液和步骤S2中所述参照物对照品溶液中化学成分的色谱图，具体的色谱参数如下：

柱温：25℃～32℃；检测器波长：330nm和/或210nm；

色谱柱：C18 4.6*250mm，5μm或2.1*50mm，1.7μm；

流动相流速为0.8～1.2mL/min；所述流动相采用梯度洗脱；

流动相A：乙腈溶液；流动相B：0.1％的磷酸溶液；

S4、根据所述参照物的浓度、所述参照物对照品溶液在色谱图中的峰面积以及百合地黄汤中与所述参照物对照品溶液相对应的成分在色谱图中的峰面积，且基于步骤S3中的检测条件，以外标法计算百合地黄汤中化学成分的含量。

本发明的有益效果是，本检测方法能够得到良好的指纹图谱，本发明的指纹图谱的相似度采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行评价，以平均数作为生成方法，按照全峰匹配方式对相似度进行评价。且能够更加准确的得到百合地黄汤中化学成分。解决了指纹图检测结果不准确，不利于百合地黄汤产品质量的控制的技术问题。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，在步骤S4中，所述梯度洗脱的程序为：

0～15min流动相A为5％～11％；15～30min流动相A为11％～12％；30～42min流动相A为12％；42～60min流动相A为12％～19％；60～65min流动相A为19％～27％；65～68min流动相A为27％～29.5％；68～70min流动相A为29.5％～33％；70～75min流动相A为33％～34％；75～80min流动相A为34％～42％；80～85min流动相A为42％～5％；85～90min流动相A为5％；

或

0～15min流动相A为5％～11％；15～30min流动相A为11％～12％；30～42min流动相A为12％；42～60min流动相A为12％～19％；60～65min流动相A为19％～27％；65～70min流动相A为27％～33％；70～80min流动相A为33％～42％；80～85min流动相A为42％～5％；85～90min流动相A为5％；

或

0～15min流动相A为5％～11％；15～30min流动相A为11％～12％；30～42min流动相A为12％；42～60min流动相A为12％～19％；60～65min流动相A为19％～27％；65～70min流动相A为27％～36％；70～78min流动相A为36％～42％；78～80min流动相A为42％～5％；80～85min流动相A为5％；

或

0～15min流动相A为5％～11％；15～30min流动相A为11％～12％；30～42min流动相A为12％；42～60min流动相A为12％～19％；60～65min流动相A为19％～27％；65～70min流动相A为27％～40％；70～75min流动相A为40％；75～76min流动相A为40％～42％；76～80min流动相A为42％～5％；80～85min流动相A为5％；

或

0～10min流动相A为5％～11％；10～25min流动相A为11％～12％；25～37min流动相A为12％；37～44min流动相A为12％～16％；44～50min流动相A为16％；50～55min流动相A为16％～24％；55～60min流动相A为24％～33％；60～70min流动相A为33％；70～74min流动相A为33％～42％；74～75min流动相A为42％～5％；75～80min流动相A为5％；

或

0～10min流动相A为5％～11％；10～25min流动相A为11％～12％；25～37min流动相A为12％；37～44min流动相A为12％～16％；44～50min流动相A为16％～18％；50～55min流动相A为18％～26％；55～60min流动相A为26％～33％；60～70min流动相A为33％；70～72min流动相A为33％～42％；72～75min流动相A为42％～5％；

或

0～10min流动相A为5％～11％；10～25min流动相A为11％～12％；25～37min流动相A为12％；37～44min流动相A为12％～16％；44～50min流动相A为16％～18％；50～53min流动相A为18％～22％；53～58min流动相A为22％～24％；58～65min流动相A为24％～36％；65～68min流动相A为36％～42％；68～70min流动相A为42％～5％；70～75min流动相A为5％。

本发明优选采用上述洗脱梯度，使得色谱图成分和含量分离度较好。

进一步，所述梯度洗脱的程序为：

0～15min流动相A为5％～11％；15～30min流动相A为11％～12％；30～42min流动相A为12％；42～60min流动相A为12％～19％；60～65min流动相A为19％～27％；65～70min流动相A为27％～36％；70～78min流动相A为36％～42％；78～80min流动相A为42％～5％；80～85min流动相A为5％；

或

0～10min流动相A为5％～11％；10～25min流动相A为11％～12％；25～37min流动相A为12％；37～44min流动相A为12％～16％；44～50min流动相A为16％～18％；50～53min流动相A为18％～22％；53～58min流动相A为22％～24％；58～65min流动相A为24％～36％；65～68min流动相A为36％～42％；68～70min流动相A为42％～5％；70～75min流动相A为5％。

本发明采用上述两个梯度为最优梯度，上述梯度条件下，色谱峰个数较多，各个色谱峰分离情况良好，不同批次样品的标准品分离效果均佳，检测结果更加准确、可靠。

进一步，在步骤S2中，所述参照物对照品溶液采用毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和地黄苷作为指纹图谱的检测参照物，并采用梓醇和毛蕊花糖苷作为检测参照物进行定量测定，其中毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和地黄苷的检测波长为330nm，梓醇的检测波长为210nm。本发明通过创造性的实验和偶然发现，梓醇的吸收波长为210nm，而毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、地黄苷的最大吸收波长为330nm，且梓醇在检测波长为310～330nm下无法检测出，所以本发明采用双波长的检测方式，既能够避免梓醇的无法检测出和更准确的得到上述成份的色谱峰，同时得到梓醇，毛蕊花糖苷，异毛蕊花糖苷和地黄苷的含量，使得含量的检测结果准确，又能够得到较好的指纹图谱，有利于控制百合地黄汤的质量。本发明采用毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和地黄苷作为指纹图谱的检测参照物，本发明所述相似度评价系统为中药色谱指纹图谱的相似度评价系统，以平均数作为生成方法，按照全峰匹配方式，对相似度进行评价，能够顺利的检出待检测的百合地黄汤中的毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和地黄苷。

进一步，所述定量测定中，所述毛蕊花糖苷的进样浓度为1.52μg/ml～192.03μg/ml，所述毛蕊花糖苷回归方程y＝36.248x-9.7553，r＝1.0000，所述梓醇的进样浓度为7.9330μg/ml～2030.8448μg/ml，所述梓醇回归方程y＝2.4368x+11.783，r＝0.9999。本发明采用毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、地黄苷和梓醇对百合地黄汤中化学成分进行定位，采用梓醇和毛蕊花糖苷作为标准品进行定量测定；不但含量结果准确和识别效果好，结果更加准确，可靠。

进一步，所述色谱柱为Waters Symmetry Shield RP-C

进一步，所述过滤为采用0.45μm滤膜过滤；所述进样量为20～40μL。

进一步，所述色谱参数为：

色谱柱温度为32℃；

所述检测器波长为330nm；

所述色谱柱为Waters Symmetry Shield RP-C18，4.6*250mm，5μm；

所述流动相流速为1.0mL/min；

所述进样量为30μL。本发明在上述色谱柱温度下，各成分与相邻色谱峰分离效果较好。上述条件下能够得到很好的指纹图谱。

进一步，所述百合地黄汤中化学成分的色谱图中有26个特征峰，保留时间分别为：

8.947min、9.553min、11.589min、16.420min、20.300min、21.487min、23.455min、26.483min、30.299min、32.341min、34.816min、38.549min、47.583min、48.781min、50.141min、52.039min、53.771min、55.325min、55.998min、57.206min、58.684min、61.247min、62.603min、63.353min、64.262min或66.079min。本发明的色谱图能够检测出26种化学成分。

本发明采用高效液相色谱和指纹图谱相结合的方法可以对百合地黄汤中化学成分进行良好的分离和鉴定，通过高效液相色谱的双波长方法可以使得结果准确、可靠，具有良好的重现性和稳定性。

本发明还提供了一种百合地黄汤中化学成分的指纹图谱的建立方法，采用上述方案所述的百合地黄汤中化学成分的检测方法。本发明指纹图谱方法相似度高，结果准确。

附图说明

图1为本发明实施例1的HPLC色谱图；

图2为本发明实施例2的HPLC色谱图；

图3为本发明实施例3的HPLC色谱图；

图4为本发明实施例4的HPLC色谱图；

图5为本发明实施例5的HPLC色谱图；

图6为本发明实施例6的HPLC色谱图；

图7为本发明实施例7的HPLC色谱图；

图8为本发明对比例1的HPLC色谱图；

图9为本发明对比例2的HPLC色谱图；

图10为本发明对比例3～6条件下的色谱图；

图11为本发明对比例7条件下的色谱图；

图12为本发明实施例11样品的重复性结果图；

图13为本发明实施例12的稳定性检测结果图；

图14为本发明实施例13中间精密度结果图；

图15为本发明实施例15耐用性结果图；

图16为本发明实施例16中的15批待测液测定结果图；

图17是图16中的样品对照指纹图谱330nm放大图，并对参照峰进行标注；

图18是图16中的样品指纹图谱210nm放大图，并对参照峰进行标注；

图1～4中：毛蕊花糖苷1，异毛蕊花糖苷2，地黄苷3。

具体实施方式

本发明提供了一种百合地黄汤中化学成分的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例1

供百合地黄汤煎液18052803批原液过滤0.45μm滤膜，加乙腈-0.1％磷酸溶液(5:95)溶解定容至10ml，过滤，取续滤液作为待测液。

分别取毛蕊花糖苷对照品、异毛蕊花糖苷对照品和地黄苷对照品适量，精密称定，分别加乙腈-0.1％磷酸溶液体积比(5:95)制成每1ml含50μg的毛蕊花糖苷对照品溶液、每1ml含50μg的异毛蕊花糖苷对照品溶液和每1ml含50μg的地黄苷对照品溶液，混合即得参照物溶液。

测定法分别精密吸取参照物溶液和待测液各30μl，注入液相色谱仪，测定，记录100min内的色谱图，即得如图1所示的色谱图。

仪器：高效液相色谱仪，该设备主要由在线脱气机、梯度泵、柱塞杆清洗、温控自动进样器、制冷型柱温箱及可变波长紫外检测器等组成。梯度泵为四元梯度泵。

色谱参数为：

色谱柱温度为32℃；

所述检测器波长为330nm；

所述色谱柱为I Waters Symmetry Shield RP-C18，4.6*250mm，5μm；

所述流动相流速为1.0mL/min；

所述进样量为30μL；

流动相A：乙腈溶液；流动相B：0.1％的磷酸溶液。

所述梯度洗脱的程序为：

0～15min流动相A为5％～11％；15～30min流动相A为11％～12％；30～42min流动相A为12％；42～60min流动相A为12％～19％；60～65min流动相A为19％～27％；65～70min流动相A为27％～36％；70～78min流动相A为36％～42％；78～80min流动相A为42％～5％；80～85min流动相A为5％。

结果如图1所示。图1为本发明实施例1的HPLC色谱图；由图1可以看出本发明实施例1的方法分离色谱峰数量多，各色谱峰分离度较高，分离效果好，能最好的展现百合地黄汤整体物质基础情况。所以能够得到很好的百合地黄汤的指纹图谱，本发明提供的百合地黄汤优选为百合地黄煎液18052803批原液。也可以是上述原液干制的粉状，对此不进行限定。

实施例2

其余同实施例1，区别为：梯度洗脱的程序为：

0～10min流动相A为5％～11％；10～25min流动相A为11％～12％；25～37min流动相A为12％；37～44min流动相A为12％～16％；44～50min流动相A为16％～18％；50～53min流动相A为18％～22％；53～58min流动相A为22％～24％；58～65min流动相A为24％～36％；65～68min流动相A为36％～42％；68～70min流动相A为42％～5％；70～75min流动相A为5％。

结果如图2所示，图2为本发明实施例2的HPLC色谱图；由图2可以看出该条件分离效果好，分离度高，分离出较为全面的物质色谱峰。

实施例3

其余同实施例1，区别为：梯度洗脱的程序为：

0～15min流动相A为5％～11％；15～30min流动相A为11％～12％；30～42min流动相A为12％；42～60min流动相A为12％～19％；60～65min流动相A为19％～27％；65～68min流动相A为27％～29.5％；68～70min流动相A为29.5％～33％；70～75min流动相A为33％～34％；75～80min流动相A为34％～42％；80～85min流动相A为42％～5％；85～90min流动相A为5％；

结果如图3所示，图3为本发明实施例3的HPLC色谱图。由图3可以看出整体色谱分离效果好，但在65～75min时间段色谱峰未完全分离，相对于实施例1和实施例2分离度较差，分离效果待进一步优化。

实施例4

其余同实施例1，区别为：梯度洗脱的程序为：

0～15min流动相A为5％～11％；15～30min流动相A为11％～12％；30～42min流动相A为12％；42～60min流动相A为12％～19％；60～65min流动相A为19％～27％；65～70min流动相A为27％～33％；70～80min流动相A为33％～42％；80～85min流动相A为42％～5％；85～90min流动相A为5％；

结果如图4所示，图4为本发明实施例4的HPLC色谱图。由图4可以看出物质基准整体分离效果较好，同实施例3相比在65～75min分离还需进一步改善。

实施例5

其余同实施例1，区别为：梯度洗脱的程序为：

0～15min流动相A为5％～11％；15～30min流动相A为11％～12％；30～42min流动相A为12％；42～60min流动相A为12％～19％；60～65min流动相A为19％～27％；65～70min流动相A为27％～40％；70～75min流动相A为40％；75～76min流动相A为40％～42％；76～80min流动相A为42％～5％；80～85min流动相A为5％；

结果如图5所示，图5为本发明实施例5的HPLC色谱图。由图5可以看出对比实施例4在65～75min分离效果有所改善，但地黄苷前后色谱峰未实现完全分离。

实施例6

其余同实施例1，区别为：梯度洗脱的程序为：

0～10min流动相A为5％～11％；10～25min流动相A为11％～12％；25～37min流动相A为12％；37～44min流动相A为12％～16％；44～50min流动相A为16％；50～55min流动相A为16％～24％；55～60min流动相A为24％～33％；60～70min流动相A为33％；70～74min流动相A为33％～42％；74～75min流动相A为42％～5％；75～80min流动相A为5％；

结果如图6所示，图6为本发明实施例6的HPLC色谱图。由图6可以看出对比实施例5，地黄苷色谱峰分离改善，但仍存在色谱图后段保留时间密集的情况。

实施例7

其余同实施例1，区别为：梯度洗脱的程序为：

0～10min流动相A为5％～11％；10～25min流动相A为11％～12％；25～37min流动相A为12％；37～44min流动相A为12％～16％；44～50min流动相A为16％～18％；50～55min流动相A为18％～26％；55～60min流动相A为26％～33％；60～70min流动相A为33％；70～72min流动相A为33％～42％；72～75min流动相A为42％～5％；

结果如图7所示，图7为本发明实施例7的HPLC色谱图。由图7可以看出各色谱峰达到基线分离，在60min前后色谱峰密集，与实施例6相比分离效果虽然可接受但有优化空间，需要改进。

对比例1

其余同实施例1，区别为：波长为315nm，结果如图8所示，图8为本发明对比例1的HPLC色谱图，由图8可以看出不同检测波长对色谱峰检出能力有区别，该波长下色谱峰数量和个数较差，所以还是实施例1中的330nm更优。

对比例2

其余同实施例1，区别为：流动相为：流动相A：乙腈溶液；流动相B：0.1％的甲酸溶液，结果如图9所示，图9为本发明对比例2的HPLC色谱图。由图9可以看出不同酸体系条件下有略微差异，实施例1的磷酸体系在峰响应上略高于对比例2的甲酸体系。

对比例3

其余同实施例1，区别为洗脱梯度不同(M3)：

所述梯度洗脱的程序为：

0～8min流动相A为5％～11％；8～23min流动相A为11％～12％；23～35min流动相A为12％；35～50min流动相A为12％～18％；50～60min流动相A为18％～24％；60～70min流动相A为24％～30％；70～80min流动相A为30％～42％；80～85min流动相A为42％～5％；85～90min流动相A为5％。

结果如图10所示，图10为本发明对比例3～5条件下的色谱图；由图10中的M3可以看出该条件基本满足对色谱峰的分离，但相对于实施例1的色谱峰在25～35min、60～75min明显分离不足，分离度差。

对比例4

其余同实施例1，区别为洗脱梯度不同(M3-1)：

所述梯度洗脱的程序为：

0～8min流动相A为5％～11％；8～30min流动相A为11％；30～35min流动相A为11％～12％；35～50min流动相A为12％～18％；50～60min流动相A为18％～24％；60～70min流动相A为24％～30％；70～80min流动相A为30％～42％；80～85min流动相A为42％～5％；85～90min流动相A为5％。

结果如图10所示，图10为本发明对比例3～5条件下的色谱图；由图10中的M3-1可以看出保留时间25～35min内分离度从4.58/1.16提升为4.90/1.1，有所改善，但相对于实施例1的保留时间明显延后，不利于色谱峰的洗脱。

对比例5

其余同实施例1，区别为洗脱梯度不同(M3-3)：

所述梯度洗脱的程序为：

0～8min流动相A为5％～10.5％；8～32min流动相A为10.5％；32～37min流动相A为10.5％～12％；37～42min流动相A为12％；42～48min流动相A为12％～42％；48～50min流动相A为42％；50～55min流动相A为42％～5％；55～60min流动相A为5％。

结果如图10所示，图10为本发明对比例3～5条件下的色谱图；由图10中的M3-3可以看出对比M3-1洗脱加快，相对于实施例1的色谱图在25～35min分离改善不明显，未达到分离预期。

对比例6

其余同实施例1，区别为洗脱梯度不同(M3-4)：

所述梯度洗脱的程序为：

0～8min流动相A为5％～11％；8～23min流动相A为11％～13％；23～35min流动相A为13％；35～50min流动相A为13％～20％；50～55min流动相A为20％～42％；55～60min流动相A为42％～5％；60～65min流动相A为5％。

结果如图10所示，图10为本发明对比例3～6条件下的色谱图；由图10中的M3-4可以看出采用本发明对比例6可以看出，洗脱加快，响应增强，但色谱峰有包裹现象，未达到分离预期。

对比例7

其余同实施例1，区别为色谱柱温度分别为30℃和32℃。

结果如图11所示，图11为本发明对比例7条件下的色谱图；由图11可以看出32℃相对分离效果好，相对于实施例1的对比实施例7在45～65min分离效果明显较差。

实施例10专属性

以乙腈-0.1％磷酸溶液(体积比为5：95)为溶剂，取百合地黄汤冻干样品1瓶，加入适量的溶剂溶解并转移至10ml量瓶中，用溶剂稀释定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

另分别取百合煎液、地黄煎液各10ml，移液至蒸发皿中，水浴挥干，加入溶剂复溶定容至10ml，混合均匀，即得百合供试品溶液和地黄供试品溶液。

另分别取梓醇、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、地黄苷对照品适量，用溶剂溶解稀释定容，分别得到0.2mg/ml梓醇定位溶液、50ug/ml毛蕊花糖苷定位溶液、1mg/ml异毛蕊花糖苷、0.2mg/ml地黄苷定位溶液。

按本发明实施例1色谱条件进行检测，结果如下和表1.1。

物质基准18112506批，总计43个色谱峰，其中4个非特征峰，百合20个色谱峰，地黄19个色谱峰。选择其中26个色谱峰进行统计，色谱峰归属如下：

百合峰：Rt 9.553，11.589，16.420，20.300，21.487，23.455，26.483，30.299，32.341，38.549，48.781，52.039，53.771，55.998，57.206，62.603min，共16个

地黄峰：Rt8.947，34.816，47.583，50.141，55.325，58.684，61.247，63.353，64.262，66.079min，共10个。

对照定位溶液

表1.1

从实验结果看，在实施例1的330nm的检测波长下，能够检测到百合地黄汤含有毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和地黄苷，但是没有梓醇。

同时，调整检测波长为210nm，其余条件与上述实施例10的内容相同，得到如下表1.2

对照定位溶液

表1.2

能够检测到百合地黄汤中含有梓醇、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和地黄苷，但是毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和地黄苷的吸收度远远差于330nm波长的检测条件。

所以为使色谱图展现更多有效成分得到更优的指纹图谱，本检测方法采用330nm作为检测波长，选用毛蕊花糖苷,异毛蕊花糖苷和地黄苷作为参照峰。

在含量检测的时候，毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和地黄苷的检测波长选择为330nm，梓醇的检测波长选择为210nm。

实施例11重复性

取18112506批冻干样品1瓶，加入适量的溶剂溶解并转移至10ml量瓶中，用溶剂(溶剂为流动相初始比例(乙腈-0.1％磷酸溶液5：95))稀释定容至刻度，摇匀。平行制备9份。于4000rpm离心处理，取上清液过0.22um微孔滤膜，取滤液作为供试品溶液。按本发明实施例1色谱条件记录色谱图12，并且采用相似度评价系统记录相似度为表2，图12为本发明实施例11样品的重复性结果图；结果如下。

根据图12和表2可以看出，9份供试品溶液色谱图完全匹配，相似度大于0.999，故说明本检测方法的重复性良好。

表2

实施例12稳定性

取重复性项下供试品溶液1分别在0h、5h、10h、15h、24h、36h、48h记录色谱图，得图13。并且采用相似度评价系统记录相似度为表3，由图13和表3可以看出，结果供试品溶液0h～48h色谱图13完全匹配，相似度0.999～1.000。表明供试品溶液在48h内稳定，故说明本检测方法的稳定性良好。图13为本发明实施例12的稳定性检测结果图。

表3

实施例13中间精密度

取18112506批冻干样品9瓶，不同的操作人员在不同时间采用不同仪器和色谱柱，按重复性制备供试品方式制备9份供试品溶液，按本发明实施例1色谱条件测定色谱图14，图14为本发明实施例13中间精密度结果图，并且采用相似度评价系统记录相似度为表4；由表4可以看出，9份供试品溶液相似度1.0

表4

实施例15耐用性

以乙腈-0.1％磷酸溶液(5：95)为溶剂，配制毛蕊花糖苷定位溶液、异毛蕊花糖苷定位溶液及地黄苷定位溶液。

另分别取地黄煎液、百合煎液及物质基准按拟定方法制备各供试品溶液，其中，地黄煎液和百合煎液直接进样，物质基准为百合地黄冻干粉，需加入溶剂溶解后进样。按本发明实施例1色谱条件，根据下述耐用性条件微调要求分别进行检测，

条件1：328nm、332nm；条件2：柱温25℃、28℃、32℃、35℃；条件3：流速0.9ml/min、流速1.1ml/min；条件4：磷酸溶液0.08％、0.12％。

结果如下：

(1)柱温25℃、35℃

柱温35℃：供试品溶液色谱峰Rt 44.922与46.015min发生位移。

柱温25℃：色谱峰Rt56.263min有包裹现象。

说明该方法对柱温较为敏感。

(2)流速0.9ml/min、1.1ml/min

结果显示该色谱方法对流速变化敏感，尤其影响毛蕊花糖苷色谱峰分离度。0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min的毛蕊花糖苷色谱峰分离度分别为1.38/2.16、2.50/1.45、3.52/0.88，说明流速微调耐用性差。当流速0.9ml/min时色谱峰50.866min、51.416min发生位置改变。

(3)耐用性条件：S1：原色谱条件；S2：328nm；S3：332nm；S4：28℃；S5：32℃；S6：0.9ml/min；S7：1.1ml/min；S8：0.08％磷酸；S9：0.12％磷酸；S10：仪器与色谱柱。

S1至S10的色谱条件下记录相似度如表5，各供试品溶液相似度大于0.99，说明该方法耐用性好。

结果如图15所示，其中图15为本发明实施例15耐用性结果图；根据图15和表5可以看出，本发明方法耐用性良好。

表5

实施例16供试品批间一致性检测

按照本发明实施例1的方法对15批待测液进行测定，结果如表6-1和图16所示，图16为本发明实施例16中的15批待测液测定结果图；结果表明百合地黄汤不同批次相似度良好。图17是图16中样品的对照指纹图谱放大图，并对参照峰进行标注。图18是图16中样品指纹图谱210nm放大图，并对参照峰进行标注。

表6-1

实施例17毛蕊花糖苷含量测定

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂为色谱柱；流动相A：乙腈溶液；流动相B：0.1％的磷酸溶液；检测波长330nm；柱温32℃；理论板数按毛蕊花糖苷峰计算不低于5000。检测条件同本发明实施例1。

对照品溶液的制备取毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加流动相制成含毛蕊花糖苷约50μg/ml的溶液，即得。

供试品溶液的制备取百合地黄汤物质基准1瓶，加适量流动相溶解并转移至10ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，使用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性供试品溶液制备称取百合饮片30g于烧杯中，加水400mL，浸泡30min，置电炉上加热至沸后保持微沸50min，煎煮至约200mL，滤过，得百合煎液。使用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各30μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

根据《中国药典》2015版四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则，对含量测定检测方法进行了专属性、线性、范围、精密度、溶液稳定性、准确度、耐用性等方法验证。

17.1系统适应性

取对照品溶液，按本实施例色谱条件，连续进样5次，记录检测结果见表6-2.

表6-2对照品溶液系统适用性结果

结果表明：对照品溶液连续进样5次RSD值小于1.0％，理论塔板数以毛蕊花糖苷计大于5000，方法系统适用性较好。

17.2专属性

按照本实施例色谱条件，制备对照品溶液、百合地黄汤物质基准供试品溶液、空白溶剂、百合供试品溶液进行检测，记录结果。结果见下表7.

表7专属性检测结果

在330nm条件下空白溶液和百合供试品溶液不干扰百合地黄汤物质基准供试品溶液中毛蕊花糖苷的检测，方法专属性较好。

17.3线性

精密称取毛蕊花糖苷(批号11530-201713，纯度92.5％)10.38mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，混匀，作为线性-1溶液(毛蕊花糖苷浓度192.03μg/ml)，精密量取线性-1溶液2ml到5ml，置5ml量瓶中，制备成线性-2溶液，精密量取线性-2溶液2ml到5ml，置5ml量瓶中，制备成线性-3溶液，依次稀释至线性-6，制备成线性溶液，并按拟定方法进行检测，记录结果。以浓度(μg/ml)作为横坐标，峰面积作为纵坐标制作线性曲线，检测结果见表8。

表8线性结果

结果表明：通过上述结果获得毛蕊花糖苷回归方程y＝36.248x-9.7553，R

17.4范围

取百合地黄汤物质基准1瓶，分别加流动相适量溶解并转移至10ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀得物质基准范围考察原液。分别量取0.8ml、1.0ml、1.2ml物质基准原液各三份，置5ml容量瓶中加流动相稀释至刻度，摇匀，使用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得80％、100％、120％范围考察供试品溶液。按确定方法进行检测，记录结果，检测结果见表9。

表9范围考察结果

结果表明：百合地黄汤物质基准中80％～120％范围内毛蕊花糖苷含量的RSD值小于3％，上述进样浓度范围内，该方法结果较好。

17.5重复性

取百合地黄汤物质基准6瓶，分别用流动相溶解并转移至10ml容量瓶中加流动相至刻度，摇匀，使用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得平行6份供试品溶液，按确定方法进行检测，记录结果，检测结果见表10。

表10重复性检测结果

结果表明：百合地黄汤物质基准样品中毛蕊花糖苷含量均值为0.4981mg/瓶，6份供试品溶液毛蕊花糖苷含量RSD值为1.5％，小于3％，重复性较好。

17.6中间精密度

由不同人员于不同仪器、不同日期按照重复性方法进行考察，记录色谱图，并与重复性结果计算中间精密度RSD值，检测结果见表11。

表11中间精密度检测结果

结果表明：6份中间精密度供试品溶液毛蕊花糖苷含量RSD值为0.5％，6份供试品中间精密度毛蕊花糖苷含量与6份供试品重复性的毛蕊花糖苷含量RSD值为1.8％，小于3％，中间精密度良好。

17.7准确度

精密量取百合地黄汤物质基准溶液原液5ml至10ml容量瓶中，再加入上述毛蕊花糖苷对照溶液使毛蕊花糖苷加入量为样品中含量的50％、100％、150％，各平行三份，再加流动相稀释至刻度摇匀，使用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液做供试品溶液。按照拟定方法进行检测，记录结果，计算准确度，结果见表12。

表12准确度考察结果

结果表明：50％～150％考察范围内，物质基准供试品溶液毛蕊花糖苷回收率97.92％～103.05％，RSD值小于5％，准确度较好。

17.8溶液稳定性

按确定色谱条件，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h、60h、72h检测供试品溶液，记录结果，结果见表13。

表13稳定性考察结果

结果表明：供试品溶液在室温放置72h内，毛蕊花糖苷含量RSD值小于2％，说明室温放置72h内供试品溶液稳定性较好。

17.9耐用性

按照拟定方法制备对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液，对柱温(±2℃)、检测波长(±2nm)、流速(±0.1ml/min)、同型号不同色谱柱等色谱条件进行耐用性考察，记录结果，结果见表14。

表14耐用性考察结果

结果表明：在色谱条件微调情况下，系统适用性均符合要求，理论板数以毛蕊花糖苷计均大于5000，所有耐用性测试供试品溶液毛蕊花糖苷含量RSD值小于3％，方法耐用性较好。

17.10百合地黄汤物质基准对应实物含量测定

15批次百合地黄汤物质基准按拟定方法测定含量，结果表15-1。15批百合地黄汤物质基准中毛蕊花糖苷含量为0.1992-0.6760mg/瓶。

表15-1百合地黄汤物质基准对应实物含量测定结果

实施例18梓醇含量测定

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂为色谱柱；流动相A：乙腈溶液；流动相B：0.1％的磷酸溶液；检测波长210nm；柱温32℃；理论板数按毛蕊花糖苷峰计算不低于5000。检测条件同本发明实施例1。

对照品溶液的制备取梓醇对照品适量，精密称定，加流动相制成含梓醇约200μg/ml的溶液，即得对照品溶液。

供试品溶液的制备取百合地黄汤物质基准1瓶，加适量流动相溶解并转移至10ml容量瓶中，使用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

阴性供试品溶液制备称取百合饮片30g于烧杯中，加水400mL，浸泡30min，置电炉上加热至沸后保持微沸50min，煎煮至约200mL，滤过，得百合煎液。使用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得阴性供试品溶液。

测定法分别精密吸取对照溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，测定，即得。

根据《中国药典》2015版四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则，对含量测定检测方法进行了专属性、线性、范围、精密度、溶液稳定性、准确度、耐用性等方法验证。

18.1系统适用性

取本实施例制备对照品溶液，按本发明实施例1色谱条件，连续进样5次，记录结果，检测结果见表15-2。

表15-2对照品溶液系统适用性结果

结果表明：对照品溶液连续进样5次RSD值小于1.0％，理论塔板数以梓醇计大于5000，方法系统适用性较好。

18.2专属性

按照本发明实施例1色谱条件，制备对照品溶液、百合地黄汤物质基准供试品溶液、空白溶剂、百合供试品溶液进行检测，记录结果。结果见下表16。

表16专属性检测结果

结果表明：在210nm条件下空白溶液和百合供试品溶液不影响百合地黄汤物质基准供试品溶液中梓醇的检出，方法专属性较好。

18.3线性

精密称取梓醇(批110808-201711，纯度99.6％)20.39mg，置10ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，混匀，作为线性-1溶液(梓醇2030.8448μg/ml)，精密量取线性-1溶液5ml，置10ml量瓶中，制备成线性-2溶液，精密量取线性-2溶液5ml，置10ml量瓶中，制备成线性-3溶液，依次稀释至线性-9，制备成线性溶液，并按拟定方法进行检测，记录结果。以浓度(μg/ml)作为横坐标，峰面积作为纵坐标制作线性曲线，检测结果见表17。

表17线性结果

结果表明：通过上述结果获得梓醇回归方程y＝2.4368x+11.783，r＝0.9999，说明在7.9330μg/ml～2030.8448μg/ml范围内，梓醇浓度与峰面积呈良好线性关系。

18.4范围

取百合地黄汤物质基准2瓶，加流动相适量溶解并共同转移至20ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀得物质基准范围考察原液。分别量取0.8ml、1.0ml、1.2ml物质基准原液各三份，置10ml容量瓶中加流动相稀释至刻度，摇匀，使用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得80％、100％、120％范围考察供试品溶液。按确定方法进行检测，记录结果，检测结果见表18。

表18范围考察结果

结果表明：百合地黄汤物质基准在80％～120％范围内梓醇含量的RSD值均小于3％，上述进样浓度范围内，该方法结果较好。

18.5重复性

取百合地黄汤物质基准6瓶，分别用流动相溶解并转移至10ml容量瓶中加流动相至刻度，摇匀，分别精密量取1.0ml溶液至10ml容量瓶中加流动相稀释至刻度摇匀，使用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得平行6份供试品溶液，按确定方法进行检测，记录结果，检测结果见表19。

表19重复性检测结果

结果表明：百合地黄汤物质基准样品中梓醇含量均值为14.8329mg/瓶，RSD值小于3％，重复性较好。

18.6中间精密度

由不同人员于不同仪器、不同日期按照重复性方法进行考察，记录色谱图，并与重复性结果计算中间精密度RSD值，检测结果见表20。

表20中间精密度检测结果

结果表明：6份中间精密度供试品溶液梓醇含量RSD值为0.8％，6份供试品中间精密度梓醇含量与6份供试品重复性的梓醇含量RSD值为2.2％，小于3％，中间精密度良好。

18.7准确度

取百合地黄汤物质基准1瓶，加适量流动相溶解并转移至10ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，量取0.5ml至10ml容量瓶中，再加入梓醇对照溶液各0.5ml、1.0ml、1.5ml使梓醇加入量为样品中含量的50％、100％、150％，各平行三份，再加流动相稀释至刻度摇匀，使用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液做供试品溶液。按照拟定方法进行检测，记录结果，计算准确度，结果见表21。

表21准确度考察结果

结果表明：50％～150％考察范围内，物质基准供试品溶液梓醇回收率94.87％～100.31％，RSD值小于5％，准确度较好。

18.8溶液稳定性

按确定色谱条件，分别于0h、4h、8h、12h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、36h检测供试品溶液，记录色谱图，结果见表22。

表22稳定性考察结果

结果表明：供试品溶液在室温放置36h内，梓醇峰面积RSD值小于1％，说明室温放置36h内供试品溶液稳定性较好。

18.9耐用性按照拟定方法制备对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液，对柱温(±2℃)、检测波长(±2nm)、流速(±0.1ml/min)、同型号不同色谱柱等色谱条件进行耐用性考察，记录结果，结果见表23。

表23耐用性考察结果

结果表明：在色谱条件微调情况下均符合系统适用性试验要求，理论板数以梓醇计均大于5000，所有耐用性测试供试品溶液梓醇含量RSD值小于3％，方法耐用性较好。

18.10百合地黄汤物质基准对应实物含量测定

15批次百合地黄汤物质基准按拟定方法测定含量，结果表24。15批百合地黄汤物质基准中梓醇含量为10.7792-17.7018mg/瓶。

表24百合地黄汤物质基准对应实物含量测定结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。