一种提高淋巴细胞密度及促进淋巴细胞向NK细胞分化的培养液及其应用

摘要

本发明涉及细胞培养技术领域，公开了一种提高淋巴细胞密度及促进淋巴细胞向NK细胞分化的培养液，所述培养液包含淋巴细胞无血清培养基和注射用A群链球菌，并且所述注射用A群链球菌与淋巴细胞无血清培养基的比率为0.8g:1L～1.2g:1L。使用本发明的培养液，能在淋巴细胞的体外培养中明显促进细胞生长，提高细胞密度，并且相比仅使用淋巴细胞无血清培养基培养细胞，细胞活率不降低；同时，使用本发明的培养液能明显使CD3+活细胞比率下降、CD56+活细胞比率上升，促进淋巴细胞向NK细胞的分化。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域。具体地，本发明涉及一种提高淋巴细胞密度及促进淋巴细胞向NK细胞分化的培养液及其应用。

背景技术

淋巴细胞是免疫系统中非常重要的一类细胞，对于人体的健康具有举足轻重的意义。它们在临床上具有多种重要的意义，包括诊断疾病、评估免疫功能、指导治疗以及预测预后等方面。根据其功能不同，临床上主要将淋巴细胞分为B淋巴细胞、T淋巴细胞和NK细胞三大类。B淋巴细胞主要介导体液免疫，T淋巴细胞主要介导细胞免疫，而NK细胞可以直接杀伤异常细胞。科学家于20世纪60年代鉴定出NK细胞，发现其具有杀伤癌细胞及被感染细胞的功能。NK细胞的表型为CD3-CD56+，主要分布于骨髓、外周血和脾脏当中，占外周血淋巴细胞的10％-20％。NK细胞主要来源于骨髓中的CD34造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell，HSC)，HSC通过发育形成NK/T祖细胞，NK/T祖细胞进一步发育为成熟NK细胞或T细胞。实质上，NK细胞是一类固有免疫细胞，是机体防御感染和抗肿瘤的第一道防线。作为免疫系统中一种重要的效应细胞，NK细胞过继性免疫疗法是细胞生物治疗方法之一。这种方法是向肿瘤患者回输经体外诱导培养的NK细胞，在机体中直接或间接杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。NK细胞无需预先致敏，且无主要组织相容性复合物(MajorHistocompatibility Complex，MHC)限制性，可杀伤肿瘤细胞或被感染的细胞，具有广谱的抗肿瘤作用。这是NK细胞区别于T细胞相关肿瘤免疫治疗的一大优势。另一优势在于，NK细胞能够靶向MHC分子缺失的肿瘤细胞，通过释放细胞毒性穿孔素和颗粒酶，从而诱发肿瘤细胞凋亡；亦可通过分泌一系列细胞因子，如γ干扰素(Interferon-gamma，IFN-γ)及肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)等，调节免疫反应而间接杀伤肿瘤细胞。因此，NK细胞在抗肿瘤免疫细胞治疗中具有巨大的潜力。与T细胞疗法相比，NK细胞拥有其独特的抗癌优势。另外，基因编辑NK细胞的可行性、安全性和NK细胞的快速杀伤肿瘤的特性，使得开发“现货型”NK细胞抗癌免疫疗法极具前景。总之，随着科学不断发展，对NK细胞更深入的研究，NK细胞未来必将在防癌抗癌等领域得到更广泛的应用。

然而，在开发NK细胞应用的过程中需要克服许多挑战，首当其冲的获得足量的NK细胞，例如在“现货型”NK细胞抗癌免疫疗法中存在NK细胞难以达到临床使用级别的体外扩增的问题。为此，找到一种能在体外细胞培养中促进NK细胞生长和表达的物质，为后续的NK细胞生物学研究和细胞治疗提供坚实的基础是一个亟待解决的问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明提供了一种提高淋巴细胞密度及促进淋巴细胞向NK细胞分化的培养液及其应用，从而解决或者至少缓解了上述问题和其它方面的问题中的一个或多个。为实现前述目的，根据本发明的第一个方面，提供一种提高淋巴细胞密度及促进淋巴细胞向NK细胞分化的培养液，其中，所述培养液包含淋巴细胞无血清培养基和注射用A群链球菌，并且所述注射用A群链球菌与淋巴细胞无血清培养基的比率为0.8g:1L～1.2g:1L。

在如前所述的培养液中，可选地，所述注射用A群链球菌与淋巴细胞无血清培养基的比率为1g:1L。

在如前所述的培养液中，可选地，所述淋巴细胞无血清培养基为源培T110KJJ431137培养基。

在如前所述的培养液中，可选地，所述注射用A群链球菌为经青霉素处理的A群溶血性链球菌的冻干品，辅料包含甲硫氨酸、麦芽糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、青霉素钾。

在如前所述的培养液中，可选地，所述注射用A群链球菌为国药集团鲁亚(山东)制药有限公司商品沙培林。

根据本发明的第二个方面，提供前述培养液用于提高淋巴细胞密度及促进淋巴细胞向NK细胞分化的用途，其中，在用淋巴细胞无血清培养基对淋巴细胞进行复苏和传代后，使用前述培养液对淋巴细胞进行传代培养。

在如前所述的用途中，可选地，所述注射用A群链球菌与淋巴细胞无血清培养基的比率为1g:1L。

在如前所述的用途中，可选地，所述淋巴细胞无血清培养基为源培T110KJJ431137培养基。

在如前所述的用途中，可选地，所述注射用A群链球菌为经青霉素处理的A群溶血性链球菌的冻干品，辅料包含甲硫氨酸、麦芽糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、青霉素钾。

在如前所述的用途中，可选地，所述注射用A球链球菌为国药集团鲁亚(山东)制药有限公司商品沙培林。

本发明的有益效果：

本发明的培养液将淋巴细胞无血清培养基与注射用A群链球菌结合，使用本发明的培养液，能在淋巴细胞的体外培养中明显促进细胞生长，提高细胞密度，并且相比仅使用淋巴细胞无血清培养基培养细胞，细胞活率不降低；同时，使用本发明的培养液能明显使CD3+活细胞比率下降、CD56+活细胞比率上升，促进淋巴细胞向NK细胞的分化。

附图说明

参照附图，本发明的公开内容将更加显然。应当了解，这些附图仅仅用于说明的目的，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。其中：

图1是以源培T110KJ J431137无血清培养基为对照，用本发明的培养液(T110KJJ431137+1g/L注射用A群链球菌)对淋巴细胞进行传代培养的生长曲线图；

图2是显示通过流式细胞术检测以源培T110KJ J431137无血清培养基传代培养(传3代)淋巴细胞后细胞表面CD3、CD4和CD8表达量的图；

图3是显示通过流式细胞术检测以源培T110KJ J431137无血清培养基传代培养(传3代)淋巴细胞后细胞表面CD8、CD56表达量的图；

图4是显示通过流式细胞术检测以本发明的培养液(T110KJ J431137+1g/L注射用A群链球菌)传代培养(传3代)淋巴细胞后细胞表面CD3、CD4和CD8表达量的图；

图5是显示通过流式细胞术检测以本发明的培养液(T110KJ J431137+1g/L注射用A群链球菌)传代培养(传3代)淋巴细胞后细胞表面CD8、CD56表达量的图。

具体实施方式

在下文中，将更全面地体现本发明的各方面以及更进一步的目的、特征和优点。本发明提供一种提高淋巴细胞密度及促进淋巴细胞向NK细胞分化的培养液，其中，所述培养液包含淋巴细胞无血清培养基和注射用A群链球菌，并且所述注射用A群链球菌与淋巴细胞无血清培养基的比率为0.8g:1L～1.2g:1L。

优选地，所述注射用A群链球菌与淋巴细胞无血清培养基的比率为1g:1L。优选地，所述淋巴细胞无血清培养基为源培T110KJ J431137培养基。

在一个实施方式中，所述注射用A群链球菌为经青霉素处理的A群溶血性链球菌的冻干品，辅料包含甲硫氨酸、麦芽糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、青霉素钾。优选地，所述注射用A群链球菌为国药集团鲁亚(山东)制药有限公司商品沙培林。

本发明还提供前述培养液用于提高淋巴细胞密度及促进淋巴细胞向NK细胞分化的用途，其中，在用淋巴细胞无血清培养基对淋巴细胞进行复苏和传代后，使用前述培养液对淋巴细胞进行传代培养。

在一个实施方式中，用淋巴细胞无血清培养基对所述淋巴细胞进行传代包括以5.0×10

优选地，所述注射用A群链球菌与淋巴细胞无血清培养基的比率为1g:1L。优选地，所述淋巴细胞无血清培养基为源培T110KJ J431137培养基。

在一个实施方式中，所述注射用A群链球菌为经青霉素处理的A群溶血性链球菌的冻干品，辅料包含甲硫氨酸、麦芽糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、青霉素钾。优选地，所述注射用A群链球菌为国药集团鲁亚(山东)制药有限公司商品沙培林。

在一个实施方式中，所述淋巴细胞购自美国模式培养物集存库(American typeculture collection,ATCC)的人白血病T淋巴细胞Jurkat，Clone E6-1，其平台编号为Bio-68218。

本申请中，所述的“包含”和“包括”涵盖还包含或包括未明确提及的其它要素的情形以及由所提及的要素组成的情形。

本申请中，术语“培养液”指用于培养淋巴细胞所使用的物质，不包括被培养的细胞本身，如淋巴细胞无血清培养基、淋巴细胞无血清培养基+注射用A群链球菌。

本申请中，术语“培养物”指用培养液培养细胞后获得的物质的总和，包括被培养的细胞。

本申请中，术语“活率”指活细胞比率。

除非另外限定，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同意义。当本说明书中术语的定义与本发明所属领域技术人员通常理解的意义有矛盾时，以本文中所述的定义为准。

实施例以下将结合实施例对本发明的构思、具体方案及产生的技术效果作进一步说明，以让本领域技术人员充分地了解本发明的目的、特征和效果。本领域技术人员不难理解，此处的实施例仅仅用于示例目的，本发明的范围并不局限于此。

实施例中采用的试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择，可市售获得。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒、仪器生产厂家推荐的方法实现。

一、实验材料淋巴细胞：购自美国模式培养物集存库(American type culturecollection,ATCC)，细胞名称：人白血病T淋巴细胞Jurkat，Clone E6-1；平台编号：Bio-68218；淋巴细胞无血清培养基：来自上海源培生物股份有限公司，货号T110KJ J431137；注射用A群链球菌：由国药集团鲁亚(山东)制药有限公司提供，商品名：沙培林；

细胞流式检测仪：厂家BeckmanCoulterLnc.型号CytoFLEXLX.。

二、实验操作

1.本发明培养液的配制

按以下步骤和表1配制含有注射用A群链球菌的淋巴细胞无血清培养基。

表1：本发明培养液组成表

步骤1：选择合适大小的容器，盛装表1中所述体积的无血清培养基；

步骤2：将表1所述质量的注射用A群链球菌粉末加入到步骤1中所述的容器中；步骤3：在室温下混合均匀，充分溶解；

步骤4：置于4～8℃保存备用。

由于注射用A群链球菌的量与淋巴细胞无血清培养基的比例为1g:1L，下文将该培养液记载为“T110KJ J431137+1g/L注射用A群链球菌”。

2.淋巴细胞的复苏以及传代

步骤1：将冻存的淋巴细胞从-196℃的液氮中取出，在40℃的水浴锅中1分钟内速融，加入到准备好的淋巴细胞无血清培养基中离心，去掉上清后与淋巴细胞无血清培养基混合后加入培养瓶中，将复苏完成的淋巴细胞在培养箱(37±2℃，5±0.5％二氧化碳)中培养；

步骤2：每2天进行一次加液操作，加入6mL淋巴细胞无血清培养基；每4天进行一次传代操作，将所有液体吸入离心管中轻轻吹打，取适量液体进行细胞计数并记录，随后离心后弃上清，加入淋巴细胞无血清培养基，细胞接种密度为5.0×10

步骤3：当细胞密度达到1.0×10

3.对照传代培养实验

淋巴细胞以5.0×10

表2：对照传代培养实验培养液配方

每次传代前进行细胞计数，得细胞密度和活率。结果见表3和图1。

表3：淋巴细胞传代培养对照表

上述表3和图1表明，接入相同细胞密度5×10

4.细胞流式检测

取3(对照传代培养实验)中培养3代后的淋巴细胞做流式检测，以不含细胞的T110KJ J431137作为空白、以T110KJ J431137传代培养的淋巴细胞培养物为对照，以T110KJ J431137+1g/L注射用A群链球菌传代培养的淋巴细胞培养物为样品1，分析CD3+和CD56+细胞活率，结果见表4和图2-4。

表4：细胞流式检测结果

其中，以空白所作的流式检测显示细胞活率为0(见表，未示出图)。对照中CD3+细胞活率为74.93％，而在样品1中CD3+细胞活率为69.70％，说明添加了注射用A群链球菌后，CD3+活细胞比率在下降。同时可以看出对照中CD56+细胞活率为0.28％，而在样品1中CD56+细胞活率为7.44％，说明添加了注射用A群链球菌后，CD56+活细胞比率在上升。众所周知，NK细胞的表型为CD3-CD56+，在按1g/L的比例添加了注射用A群链球菌后,使淋巴细胞的培养明显产生CD3+下降、CD56+上升的趋势，说明本发明的培养液具有促进淋巴细胞向NK细胞分化的能力。以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对发明的保护范围进行限制。基于这些实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明所保护的范围。尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员依然可以在不冲突的情况下，对本发明实施例中的特征根据情况进行组合、增删或者作其他调整，从而得到不同的、本质未脱离本发明的构思的其他技术方案，这些技术方案同样属于本发明所要保护的范围。