脂肪酸去饱和酶改良基因及其应用

摘要

本发明公开了一种亚麻荠δ(12)‑脂肪酸去饱和酶改良基因和星油藤脂肪酸去饱和酶改良基因，以及包含上述改良基因的表达盒和表达载体。利用玉米胚特异启动子pZmESP和pZmMT分别启动经密码子优化及氨基酸取代的亚麻荠δ(12)‑脂肪酸去饱和酶改良基因和星油藤脂肪酸去饱和酶改良基因在玉米胚中表达，能够提高玉米胚中的α‑亚麻酸含量，并且可以提高玉米的产量。

说明书

技术领域

本申请涉及基因工程和蛋白质工程领域，具体而言，涉及一种脂肪酸去饱和酶改良基因及其应用。

背景技术

α-亚麻酸(α-Linolenic acid,ALA，十八碳9,12,15-三烯酸)是有三个双键的多元不饱和脂肪酸(C

脂肪酸脱饱和酶2(FAD2)和脂肪酸脱饱和酶3(FAD3)是多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids，PUFA)生物合成途径经最基础的两步限速酶，FAD2能够催化油酸(OA)形成亚油酸(LA)，FAD3能够催化亚油酸(LA)形成α亚麻酸(ALA)。专利申请CN109837290A公开了奇亚ShFAD2基因家族和ShFAD3基因家族在创制高产ALA的转基因植物中的应用；通过导入外源基因使植物获得新的性状或增强原有性状并能稳定遗传是生物育种的最终目的。专利申请CN109837290A在转基因的过程中利用一个启动子启动融合基因的表达可能会造成基因表达减弱或后代不能稳定遗传的现象，以致严重影响转基因植株的获得和后代纯合植株的稳定性。并且利用同样的启动子分别启动两个基因，也可能会引起基因沉默的现象。

CN102277375A公开了一种将胚乳特异表达ω-3脂肪酸脱氢酶基因的表达盒导入水稻中以提高转基因水稻种子中，α-亚麻酸含量的方法；玉米胚芽油是从玉米胚芽中提炼出的油，不仅富含人体所需的不饱和脂肪酸，还含有多种对人体有益的成分，其余油料作物还有大豆、油菜、亚麻和棕榈等。专利申请CN102277375A以水稻为底盘植物，但水稻本身不是油料作物，油酸和亚油酸含量较低，不能作为生产高α-亚麻酸的底盘植物。CN110066812A公开了植物亚麻酸合成酶基因CsFAD2-2，该基因可以能够将植物体内的油酸及亚油酸催化生成亚麻酸。△12-脂肪酸脱氢酶基因(FAD2)最主要的功能就是植物脂肪酸生物合成代谢过程中催化油酸向亚油酸转化。CN110066812A专利申请中仅转化了一个CsFAD2-2基因，虽然具有催化亚油酸向亚麻酸转化的功能，但转化效率不能达到最高。

前人研究表明在转基因的过程中利用一个启动子启动融合基因的表达可能会造成基因表达减弱或后代不能稳定遗传的现象，以致严重影响转基因植株的获得和后代纯合植株的稳定性。并且利用同样的启动子分别启动两个基因，也可能会引起基因沉默的现象。

随着社会高速发展和生活品质的提高，使市场对植物油脂的需求开始向高品质、保健品转变，因此，有必要探索提高植物中α-亚麻酸含量的方法。

发明内容

本发明提供了一种亚麻荠δ(12)-脂肪酸去饱和酶(CsFAD2)改良基因，CsFAD2的编码基因来源于亚麻荠，其编码区序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；根据玉米中密码子偏好性对CsFAD2进行密码子优化及氨基酸替换以提高CsFAD2在玉米中的活性，获得所述亚麻荠δ(12)-脂肪酸去饱和酶改良基因，并命名为CsFAD2-Ma。CsFAD2-Ma的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者，所述亚麻荠δ(12)-脂肪酸去饱和酶改良基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种星油藤脂肪酸去饱和酶(PvFAD3)改良基因，PvFAD3的编码基因来源于星油藤，其编码区序列如SEQ ID NO.5所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；根据玉米中密码子偏好性对PvFAD3进行密码子优化及氨基酸替换以提高PvFAD3在玉米中的活性，获得所述星油藤脂肪酸去饱和酶改良基因，并命名为PvFAD3-Ma，PvFAD3-Ma的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，或者，所述星油藤脂肪酸去饱和酶改良基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供一种包含亚麻荠δ(12)-脂肪酸去饱和酶改良基因(CsFAD2-Ma)的表达盒，其中，介导所述亚麻荠δ(12)-脂肪酸去饱和酶改良基因过表达的启动子为玉米pZmESP启动子。

本发明还提供一种星油藤脂肪酸去饱和酶改良基因(PvFAD3-Ma)的表达盒，其中包含介导所述星油藤脂肪酸去饱和酶改良基因(PvFAD3-Ma)过表达的启动子为玉米pZmMT启动子。

介导CsFAD2-Ma和PvFAD3-Ma过表达的胚特异表达启动子来源于玉米，也可以通过人工合成获得。

进一步的，所述表达盒中介导所述亚麻荠δ(12)-脂肪酸去饱和酶改良基因(CsFAD2-Ma)和所述星油藤脂肪酸去饱和酶改良基因(PvFAD3-Ma)过表达的终止子为Nos。介导CsFAD2-Ma和PvFAD3-Ma过表达的终止子可以来源于真核生物或者原核生物，也可以通过人工合成获得。

更进一步的，所述表达盒中依次包括玉米pZmESP启动子、亚麻荠δ(12)-脂肪酸去饱和酶改良基因、Nos终止子、玉米pZmMT启动子、星油藤脂肪酸去饱和酶改良基因、Nos终止子。

本发明还提供一种表达载体，所述表达载体包含前述的表达盒。

进一步的，将前述的表达盒连入T-DNA载体中获得所述表达载体。

所述表达载体的构建方法可以是：转化玉米的T-DNA载体含有抗草甘膦基因EPSPS，再分别连入过表达CsFAD2-Ma基因表达框和过表达PvFAD3-Ma基因表达框。本发明中过表达CsFAD2-Ma基因表达框和过表达PvFAD3-Ma基因表达框通过分子聚合的方法构建在同一个载体的T-DNA上。

也可以构建pZmESP-CsFAD2-Ma-Nos-pZmMT-PvFAD3-Ma-Nos基因过表达框，再连入T-DNA载体中。

本发明还提供一种前述的改良基因、表达盒，或者表达载体在提高玉米胚中的α-亚麻酸含量中的应用。

进一步的，所述应用具体为使玉米过表达所述亚麻荠δ(12)-脂肪酸去饱和酶改良基因和所述星油藤脂肪酸去饱和酶改良基因。具体的，可以通过转基因的方法将构建好的重组表达载体转入到受体植物基因组中，从而使得目标植株中获得同时表达所述亚麻荠δ(12)-脂肪酸去饱和酶改良基因和所述星油藤脂肪酸去饱和酶改良基因的转基因植株。

本发明的有益效果包括：

本发明利用玉米胚特异表达的启动子pZmESP和pZmMT分别启动经密码子优化及氨基酸取代的亚麻荠δ(12)-脂肪酸去饱和酶(CsFAD2-Ma)和星油藤脂肪酸去饱和酶(PvFAD3-Ma)在玉米胚中表达，既能保证2个基因的高水平表达，并且利用不同的启动子分别表达多个基因能够获得后代稳定遗传的转基因植株。

同时，本发明通过使玉米植株过表达亚麻荠δ(12)-脂肪酸去饱和酶改良基因和所述星油藤脂肪酸去饱和酶改良基因，提高了玉米胚中的α-亚麻酸含量，并且提高玉米的产量。其中CsFAD2-Ma蛋白能够催化油酸脂肪酸中双键的形成合成亚油酸，PvFAD3-Ma蛋白能够催化亚油酸脂肪酸中双键的形成合成α-亚麻酸。在玉米胚中过表达CsFAD2-Ma和PvFAD3-Ma脂肪酸去饱和酶，获得的转基因植株OEFAD-Ma玉米胚的三种不饱和脂肪酸与非转基因的对照相比，亚麻酸的含量由1.66％增至8.98％～9.89％，亚油酸的含量由28.36％增至49.14％～50.33％，玉米单株产量增加3.6％-5.1％；与转基因植株OEFAD相比亚油酸含量提高7.8％～11.6％，亚麻酸含量较OEFAD提高31％～48％。

玉米自身所含不饱和脂肪酸比例为84％以上，可作为生产α-亚麻酸的底盘植物。本发明所获得转基因玉米的α-亚麻酸含量最高可达9.89％。并且亚油酸和亚麻酸含量比例为5：1，更符合现代人体营养学的推荐比例，且玉米胚芽油为低温萃取出的油，可更有效的保护α-亚麻酸成分不易被氧化。

附图说明

图1为表达载体OEFAD-Ma构建示意图；

图2为转基因玉米OEFAD-Ma产量分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、载体构建

构建CsFAD2-Ma和PvFAD3-Ma基因过表达框，人工合成了pZmESP-CsFAD2-Ma-Nos-pZmMT-PvFAD3-Ma-Nos基因过表达框，依次包含pZmESP启动子、CsFAD2-Ma编码基因、Nos终止子、pZmMT启动子、PvFAD3-Ma编码基因和Nos终止子。其中，为了提高CsFAD2在玉米中的活性，根据玉米中密码子偏好性对CsFAD2进行密码子优化及氨基酸替换，得到CsFAD2-Ma，其编码序列如SEQ ID NO.3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。为提高PvFAD3在玉米中的活性，根据玉米中密码子偏好性对PvFAD3进行密码子优化及氨基酸替换，得到PvFAD3-Ma，其编码序列如SEQ ID NO.7所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。玉米pZmESP启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，玉米pZmMT启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。终止子Nos，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

pZmESP-CsFAD2-Ma-Nos-pZmMT-PvFAD3-Ma-Nos基因过表达框的5’端和3’端分别设置有BamHI和KpnI位点把pZmESP-CsFAD2-Ma-Nos-pZmMT-PvFAD3-Ma-Nos基因过表达框连入T-DNA载体中，利用EPSPS筛选标记，构建成终载体EPSPS-pZmESP-CsFAD2-Ma-Nos-pZmMT-PvFAD3-Ma-Nos，载体命名为OEFAD-Ma(图1)。

作为转基因对照，用同样的方法构建CsFAD2和PvFAD3的基因过表达框的载体EPSPS-pZmESP-CsFAD2-Nos-pZmMT-PvFAD3-Nos，命名为OEFAD。其中，CsFAD2的编码基因来源于亚麻荠，其编码区序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。PvFAD3的编码基因来源于星油藤，其编码区序列如SEQ ID NO.5所示，其氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。

最后，通过电转的方法把T-DNA质粒转入农杆菌LB4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。

实施例2、玉米转化

1.玉米幼胚的准备

将公司内部玉米自交系AX808种植于大田或是温室，取人工授粉后8-10天(夏季)/10-13天(秋季)的玉米作为幼胚的来源。

2.农杆菌的准备

(1)取已转化鉴定好的农杆菌甘油菌在添加有100mg/L kan和12mg/Ltet的YEP固体培养基上划线，28℃暗培养2-3天；

(2)在灭菌的2ml离心管中加入1ml侵染培养基，取步骤1的农杆菌放入侵染培养基中，并用移液枪充分打散混匀；

(3)另取一灭菌的2ml离心管，用侵染培养基调菌液浓度，使OD 660到0.5-0.7。

3.玉米幼胚与农杆菌的共培养

(1)除去装幼胚离心管中的侵染培养基，加入1.5ml新鲜侵染培养基将胚清洗一次；

(2)除去侵染培养基，加入调好的农杆菌菌液；

(3)最大转速震荡30s，室温放置5min；

(4)将胚倒到共培养基上，吸干液体；

(5)将胚平面朝上，盾面朝上放置；

(6)将胚放到22℃暗培养2-3天。

4.愈伤的诱导和筛选

(1)共培养后的胚转到诱导愈伤培养基上，28℃培养箱中暗培养7-10天；

(2)将诱导好的愈伤转到筛选培养基上进行筛选培养，筛选压为5.0mM草甘膦，28℃暗培养2-3周；

(3)取第一次筛选存活的愈伤进行第二次筛选，筛选压同为2.0mM草甘膦。

5.转化株系的再生与培养

(1)取筛选后长出的胚性愈伤放到预分化培养基上，28℃暗培养10-14天；

(2)取胚性愈伤到分化培养基上，28℃光培养10-14天，直到幼苗分化出来；

(3)将分化好的幼苗转到生根培养基上，28℃光培养，直到根发育完全；

(4)将长势良好的幼苗移栽至温室基质内。

待转基因植株开花结实后收种。将收获的种子播种在温室，植株长到4-6叶期时，采用PCR技术进行表达分析检测。

实施例3转基因玉米的鉴定

对玉米胚组织的脂肪酸成分进行分析。脂肪酸成分分析方法为气相色谱法。取300mg玉米叶片或种子研碎后，加入2.5％(v/v)硫酸-甲醇溶液2.0mL于70℃水浴中加热30min。冷却后加入5mL 1％ NaCl(w/v)震荡混匀，室温静置5min。加入3mL正己烷，混匀，室温静置10min以提取甲酯化产物。室温9 000r/min离心10min，取出最上层液体于离心管中，过滤后上GC柱进行样品脂肪酸成分分离、鉴定。本实施例中使用配备FID检测器的Agilent6890N气相色谱仪，Agilent HP-88毛细管柱(100.0m×0.25mm×0.2μm)；起始柱温为120℃，保持10min，然后以3.2℃/min升至230℃，保持35min；载气为高纯氮气，流速为0.70mL/min；氢气流速为30mL/min；空气的流速为450mL/min；采用分流进样，分流比设为20：1；汽化室的温度为250℃；检测器的温度为250℃；进样量2μL。

转基因植株OEFAD-Ma玉米胚的三种不饱和脂肪酸与非转基因的对照AX808(CK)相比，亚麻酸(C18:3)的含量由1.66％增至8.98％～9.89％，亚油酸(C18:2)的含量由28.36％增至49.14％～50.33％，而相应的油酸(C18:1)含量有所减少(表1)。上述结果表明，CsFAD2-Ma和PvFAD3-Ma基因在玉米胚中行使了去饱和酶功能，最终使得玉米胚中的亚麻酸和亚油酸含量大幅度增加。

表1脂肪酸含量测定

注：表1数据为不同脂肪酸成分占总脂肪酸成分的百分比

与OEFAD转基因植株相比，经密码子优化及氨基酸取代形成的OEFAD-Ma转基因植株亚油酸和亚麻酸含量均有不同程度提高，亚油酸含量较OEFAD提高7.8％～11.6％，亚麻酸含量较OEFAD提高31％～48％。上述结果表明经密码子优化及氨基酸取代后，两个脂肪酸去饱和酶的活性有较大程度提高。

另外，如图2所示，本发明中转基因玉米OEFAD-Ma的产量均有一定程度提高，与对照AX808相比，OEFAD-Ma转基因玉米的单株产量提高3.6％～5.1％。与转基因玉米OEFAD相比，OEFAD-Ma转基因玉米的单株产量也有所提高。