一种精氨酸修饰肌原纤维蛋白制备的稳定高内相皮克林乳液及其在3D打印中的应用

摘要

本发明公开了一种精氨酸修饰肌原纤维蛋白制备的稳定高内相皮克林乳液及其在3D打印中的应用，属于皮克林乳液技术领域。本发明在超声条件下制备了AMP复合颗粒，其作为稳定剂制备油相80％的高内相皮克林乳液。本发明发现AMP复合物制备的HIPPEs体系拥有良好的稳定性、粘弹性及触变恢复能力，具有友好的环境稳定、热处理及离心稳定性。HIPPEs的倒棱台的模型的3D打印证实了其具有良好的挤出性和打印性能，尤其在Arg含量为0.5％时打印精度显著提升。本发明为利用动物性蛋白制备HIPPEs并作为3D打印油墨提供一种新的策略。

说明书

技术领域

本发明涉及皮克林乳液技术领域，特别是涉及一种精氨酸修饰肌原纤维蛋白制备的稳定高内相皮克林乳液及其在3D打印中的应用。

背景技术

Pickering乳状液(Pickering emulsion)，是指以超细固体颗粒作为乳化剂而得到的乳状液，亦称作Pickering乳液。许多研究表明，蛋白颗粒具有作为高内相Pickering乳液(HIPPEs)稳定剂的优良潜质。然而，目前对于植物性蛋白颗粒的高内相Pickering乳液(β-伴大豆球蛋白、花生分离蛋白、和玉米醇溶蛋白、紫苏蛋白)的研究已较为深入，对于动物性蛋白颗粒的研发逐渐成为学者目前研究的重点。

罗非鱼是世界主要养殖的淡水经济类鱼类。前期研究表明，罗非鱼肌原纤维蛋白(Myofibrillar protein，MP)在乳化方面具有优越的性能。利用罗非鱼MP制备稳定的乳液凝胶(油相0.68)应用于鱼糜中脂质含量(35wt％)的提升。但研究也表明，罗非鱼MP颗粒不能用于稳定的高内相Pickering乳液。

发明内容

本发明的目的是提供一种精氨酸修饰肌原纤维蛋白制备的稳定高内相皮克林乳液及其在3D打印中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种精氨酸-肌原纤维蛋白复合物的制备方法，其特征在于，将精氨酸和罗非鱼肌原纤维蛋白溶解，经超声反应得到。

优选的是，所述精氨酸的添加量为0.5％(w/v)。

优选的是，所述罗非鱼肌原纤维蛋白的添加量为1.5wt％。

优选的是，所述超声反应的条件为在4℃、300W超声波条件下反应15min。

本发明还提供所述制备方法得到的精氨酸-肌原纤维蛋白复合物。

本发明还提供一种皮克林高内相乳液，包含所述的精氨酸-肌原纤维蛋白复合物和油相。

优选的是，所述油相包括玉米油。

优选的是，所述玉米油与精氨酸-肌原纤维蛋白复合物的油相比为0.8。

本发明还提供所述皮克林高内相乳液的制备方法，将所述精氨酸-肌原纤维蛋白复合物与油相混合，经一步均质法制备得到。

本发明还提供一种食品级3D打印材料，包括所述的皮克林高内相乳液。

L-精氨酸(Arg)是一种碱性氨基酸小分子添加剂，能够增加MP的乳化性能，此外，Arg对于心血管和肾脏疾病具有一定预防作用。但目前，Arg主要作为低盐条件下改善肉制品的质构及风味增强，研究也只要集中在加盐条件下Arg对乳化肉制品的作用机制。然而，无盐条件下Arg对MP的乳化特性影响则鲜有报道。此外，Arg-MP复合颗粒制备高内相Pickering乳液的研究同样也缺乏。

3D打印油墨的材料特性和流变特性是影响3D打印性能的关键因素，而HIPPEs因其高稳定性、强自支撑性和良好的流变性能而成为一种理想的食品级油墨。利用海鲈鱼蛋白微凝胶稳定的HIPPEs，使荷载虾青素的HIPPEs可作为食品级3D打印材料成为可能。以转谷氨酰胺酶(TGase)诱导可改善含有绵羊血浆蛋白的鱼糜的凝胶特性和3D打印精度。以磷酸化紫苏分离蛋白-壳聚糖复合纳米粒子(LZPI-CS CNPs)制备的高内相Pickering乳液(HIPPEs)作为3D打印油墨，表现出优异的稳定性和打印保真率，而且提高了β-胡萝卜素的生物可及性。但到目前为止，用于可打印HIPPEs的动物蛋白的研究仍然比较少，3D打印的发展仍然具有挑战性。

本发明公开了以下技术效果：

本发明在超声条件下制备了AMP复合颗粒，其作为稳定剂制备油相80％的HIPPEs。对AMP进行了理化性质表征，研究了HIPPEs的制备条件，通过对微观形态，流变行为、界面蛋白变化、环境稳定性对HIPPEs进行了系统研究，考察了其作为可作为3D打印油墨的可行性。本发明发现：(1)Arg的加入影响MP的交联形态和亲/疏水性及乳化能力，当Arg含量为0.5％，MP含量为1.5wt％时，形成的AMP复合物是一种稳定的Pickering稳定性。(2)AMP复合物制备的HIPPEs体系拥有良好的稳定性、粘弹性及触变恢复能力，具有友好的环境稳定、热处理及离心稳定性。(3)HIPPEs的倒棱台的模型的3D打印证实了其具有良好的挤出性和打印性能，尤其在Arg含量为0.5％时打印精度显著提升。本发明为利用动物性蛋白制备HIPPEs并作为3D打印油墨提供一种新的策略。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同Arg含量对AP的和浊度，不同字母表示差异显著(p＜0.05)；

图2为不同Arg含量对AMP的电位(A)和粒径(B)，不同字母表示差异显著(p＜0.05)；

图3为不同Arg含量对AMP的表面疏水性，不同字母表示差异显著(p＜0.05)；

图4为不同Arg含量对AMP的活性巯基(R-SH)与总巯基(T-SH)，不同字母表示差异显著(p＜0.05)；

图5为不同Arg含量对AMP的内源荧光光谱；

图6为不同Arg含量对AMP的紫外吸收光谱；

图7为不同Arg含量对AMP的傅里叶红外光谱图(A)和二级结构含量(B)，不同字母表示差异显著(p＜0.05)；

图8为不同Arg含量对AMP的电泳图，非还原条件下的电泳图(A)和还原条件下的电泳图(B)；

图9为不同Arg含量对AMP的扫描电镜图，(比例尺为10μm)；

图10为不同Arg含量对Arg-MP的三相接触角，不同字母表示差异显著(p＜0.05)；

图11为不同Arg含量对AMP的黏度曲线图；

图12为不同Arg含量对AMP的乳化稳定性和乳化活性，不同字母表示差异显著(p＜0.05)；

图13为不同Arg含量制备的乳液的外观及光学显微镜微观图(A)、频率扫描图(B)和粒径(C)，不同MP含量制备的乳液的外观及光学显微镜微观图(D)、频率扫描图(E)和粒径(F)，不同油相制备的乳液的外观及光学显微镜微观图(G)、频率扫描图(H)和粒径(I)，不同字母表示差异显著(p＜0.05)(比例尺为20μm)；

图14为不同MP含量制备的HIPPEs的外观及光学显微镜微观图和CLSM图(A)，HIPPEs在不同分散剂中的稳定性的外观和微观(B)、粒径大小(C)；

图15为HIPPEs的频率扫描图(A)、角频率扫描图(B)、小幅振荡剪切(SAOS)流变学行为(C)、粘度与剪切速率曲线(D)和触变恢复曲线图(E)；

图16为HIPPEs的拉曼图像(A)、二级结构含量(B)、二硫键构象含量(C),不同字母表示差异显著(p＜0.05)；

图17为HIPPEs在不同pH值溶液中的稳定性(A)，HIPPEs在不同离子强度的溶液中的稳定性(B)，HIPPEs冻融稳定性的外观和微观图(C)、频率扫描图(D)，HIPPEs热稳定性的外观和微观图、频率扫描图(E)，HIPPEs离心稳定性外观图(F)，不同字母表示差异显著(p＜0.05)，(比例尺为20μm)；

图18为HIPPEs的3D打印图(A)、打印精度(B)和蒸煮损失(C)，不同字母表示差异显著(p＜0.05)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。

实施例1罗非鱼MP的制备

MP的提取是根据实验室研究的方法进行的(Pei et al.,2023)，在低磷酸盐缓冲液(0.05mol/LNaCl，3.38mmol/LNaH

实施例2

1.Arg改性MP(AMP)的制备

将罗非鱼MP分散在去离子水中，在漩涡仪处理2min，获得1.5wt％MP溶液，在4℃存储。

称取一定质量的Arg，将其溶于1.5wt％MP溶液中，控制最终浓度为0、0.5、1.0、1.5和2.0％(w/v)，并在4℃和300W超声波条件下15min，使Arg与MP相互作用，最终的混合物储存在4℃。

2.AMP的性质检测

2.1浊度的测定

将上述得到的AMP溶液(MP浓度为1.5wt％，Arg浓度为0、0.5、1.0、1.5和2.0％)，分别将AMP溶液均稀释10倍。在室温放置30min后，使用紫外分光光度计在340nm处测定上清液的浊度，平均测定三次。

如图1所示，体系中随着Arg含量的增加，浊度先上升再下降。体系中Arg含量为0.0％时，浊度最低，MP以聚集状态的形式存在体系中；当Arg含量为0.5％，可溶性的AMP复合物的形成，体系的浊度显示最大；随着Arg含量的继续提升，体系的浊度逐渐降低，可溶性的AMP复合物发生聚集，可能是由于体系中静电相互作用减弱所致。

2.2粒径和Zate电位的测定

将AMP溶液(MP浓度为1.5wt％，Arg浓度为0、0.5、1.0、1.5和2.0％)使用激光粒度仪进行粒径测定。记录表面积平均液滴大小(d

采用Zetasizer Pro测定Zeta电位。配制AMP溶液(MP浓度为1.5wt％，Arg浓度为0、0.5、1.0、1.5和2.0％)，分别将AMP溶液均稀释10倍。测定温度为25℃，平均测定三次。

如图2中A所示，MP具有负电荷，Zeta电位为-20.41mV。Arg含量为0.5％时，AMP颗粒的Zeta负电位明显减小，静电相互作用力排斥力增强，导致体系分散性强，与浊度结果一致；当Arg含量在1.0-2.0％时，Zeta电位负电位显著增加，但差异性不显著，静电相互作用力排斥力减弱，AMP颗粒发生聚集，导致浊度降低。

AMP粒度分布可以进一步直观地反映AMP的聚集行为。如图2中B所示，与MP对照组相比，AMP的粒度d

2.3表面疏水性的测定

AMP溶液终体积为10mL，其中Arg浓度为0、0.5、1.0、1.5和2.0％，每组Arg浓度下MP浓度分别为0.09375，0.1875、0.375、0.75wt％。未添加Arg组为对照。然后将20μL 8.0mmol/LANS(0.1mol/L磷酸钠缓冲液pH＝6.8)加入到制备好的样品中，涡旋混合(30s)。采用荧光分光光度计进行测定，分别设置激发波长和发射波长为370nm和426nm，狭缝校正为5nm。暗处静置反应10min的每个浓度的蛋白质样品进行测定。蛋白质分子的表面疏水性即是初始阶段的斜率。

不同含量AMP的表面疏水基团含量的变化如图3所示，与对照组相比，随着Arg含量的增加，AMP的表面疏水基团也随着显著增加(p<0.05)，Arg提供的碱性环境增大了蛋白质分子间的斥力，增大了疏水基团强度，从而增加AMP的表面疏水性。在Arg含量为0.5％时，AMP的表面疏水性达到最大。但随着Arg含量的继续增加，表面疏水性降低，可能是由于精氨酸的添加时蛋白体系的静电相互作用力降低，导致蛋白体系中颗粒聚集的发生，暴露的疏水基团又被包埋。

2.4总巯基含量及活性巯基含量的测定

参考冷利萍(冷利萍，2019)的方法并略修改。采用DTNB法进行疏基含量测定。AMP溶液测定样品为：MP浓度为1.5wt％，Arg浓度为0、0.5、1.0、1.5和2.0％。

如图4所示，与对照组相比，随着Arg的添加，AMP的总巯基含量和活性巯基含量增加。这是因为Arg可以使更多的SH基团暴露于蛋白质表面，使巯基含量增加。在Arg含量为0.5-2.0％时，AMP的活性巯基随着Arg浓度的增加而减少，可能与AMP引起的聚集有关。

2.5内源荧光的测定

利用荧光光谱仪对AMP溶液(MP浓度为1.5wt％，Arg浓度为0、0.5、1.0、1.5和2.0％)进行光谱扫描，设置激发波长295nm，发射光谱范围为300-400nm，扫描范围为300-450nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描3次。

如图5所示，与对照组相比，Arg的加入使AMP的荧光强度增加，说明Arg与MP发生了相互作用，三级结构发生了变化。但随着Arg含量的增加，荧光强度逐渐减低，与表面疏水性结果一致，蛋白结构从相对松散的状态逐渐紧密，导致荧光淬灭。

2.6紫外吸收光谱的测定

参考冷利萍(冷利萍，2019)的方法并略修改。AMP溶液测定样品为：MP浓度为1.5wt％，Arg浓度为0、0.5、1.0、1.5和2.0％。紫外可见分光光度计扫描范围为200-400nm。

如图6所示，与对照组相比了，Arg的加热改变了蛋白整体的图谱趋势，且随着Arg含量的增加，AMP在250nm和280nm附近都发生了明显的红移现象，并且有增色效应，表明Arg改变了MP构象，且随着Arg含量的增加，紫外吸收光谱强度降低，可能与AMP的聚集有关。

2.7红外吸收光谱的测定

采用ATR-FTIR光谱仪分析AMP溶液的FTIR光谱(Fan et al.,2017)。AMP溶液(MP浓度为1.5wt％，Arg浓度为0、0.5、1.0、1.5和2.0％)冻干后使用。将样品与溴化钾按照1:100的比例混合，研磨后过100目筛子。样品的FTIR光谱是在4000-400cm

如图7所示，与对照组相比，Arg的添加使α-螺旋含量显着降低，而β-折叠、β-转角或无规卷曲含量增加。但随着Arg含量的增加，α-螺旋、无规则卷曲、β-转角逐渐增加，β-折叠逐渐较小。Arg含量的增加使AMP的分子刚性结构增加，柔性结构减少，氢键作用增强，蛋白分子紧缩。α-螺旋含量的增加，使分子内部的疏水性位点被包埋，表面疏水性减弱，与疏水结果一致。

2.8十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

将AMP溶液(MP浓度为1.5wt％，Arg浓度为0、0.5、1.0、1.5和2.0％)与5％SDS溶液以1:9比例放入离心管中，均质7000rpm，3min。加入等比例的上样缓冲液(含DTT/不含DTT)，然后煮沸10min。电泳调节电压为100v，等样品跑成一条直线时，增大电压至120V。用染色液染色5min后，用脱色液(含10％冰乙酸，40％无水乙醇)脱色直至蛋白质区带清晰。然后使用凝胶成像系统和Image Lab软件分析凝胶。

如图8所示，通过SDS-PAGE，不同含量的Arg在非还原(A)和还原(B)条件下对蛋白交联、聚集和降解的影响，其中包括五种蛋白的主要条带，分别为肌球蛋白重链(MHC，220kDa)、副肌球蛋白(100kDa)、肌动蛋白(43kDa)、原肌球蛋白(37kDa)和五条肌球蛋白轻链(15、16、18、19和24kDa)。在非还原条件下，与对照组相比，随着Arg含量的增加，MHC和肌动蛋白条带未有显著变化，说明Arg添加未显著影响蛋白交联聚集。而在还原条件下，浓缩胶顶部仍然存在累积条带，MHC和肌动蛋白、肌球蛋白轻链条带均明显加粗，这表明除了二硫键外，其他一些共价键也参与蛋白质交联。蛋白质交联的形成导致聚合物的形成。

2.9扫描电镜SEM微观形态观察

AMP溶液(MP浓度为1.5wt％，Arg浓度为0、0.5、1.0、1.5和2.0％)先在-60℃预冻，在真空冷冻干燥器中脱水12h，得到的蛋白质粉末涂上金颗粒，用扫描电镜1500×观察，电压为5kv。

如图9所示为1000×倍数下观察的样品的扫描电镜图像。未添加Arg的MP微观结构呈现片层纤维化细丝，在Arg含量为0.5％时，由于静电相互作用力排斥力增强，导致微观结构出现明显的细丝结构，随着Arg含量的增加，静电相互作用力排斥力减弱，细丝结构发生聚合，在Arg含量为2.0％时，微观结构为片层结构。显然而知，Arg改变了蛋白质之间的静电相互作用，进而导致其微观结构的变化。

2.10三相接触角的测定

将冻干颗粒粉末的AMP(MP浓度为1.5wt％，Arg浓度为0、0.5、1.0、1.5和2.0％)压制成圆柱形薄片(13mm×1mm)，将其浸入装有玉米油的石英方形比色皿中，然后使用高精度注射器将5uL去离子水缓慢滴在圆柱形薄片的表面上，通过水滴角测试仪对其进行测量分析。随后使用高速摄像机拍摄记录液滴在一段时间内液滴形状变化的图片。每个样品测量三次。

如图10所示，Arg含量为0.5％和1.0％，AMP的三相接触角为88.59±4.26°、93.00±1.36°，具有良好的亲水/疏水平衡，有利于油水界面的稳定。但是随着Arg含量的进一步增加，三相接触角θ下降，趋于亲水状态。

2.11AMP溶液黏度流变的测定

使用流变仪测定AMP溶液(MP浓度为1.5wt％，Arg浓度为0、0.5、1.0、1.5和2.0％)的黏度变化，进行了动态频率扫描。应变设置为1.0％，剪切率的范围是0.1到100s

如图11可知，对照组的表观粘度极小，Arg含量0.5％-2.0％时表观粘度随剪切速率的增加而降低，变稀的流动行为表明体系是一种假塑性流体。Arg含量为0.5％时，体系的表观粘度最高，流体假塑性最好。随着Arg含量的继续增加，体系表观黏度减小，蛋白体的聚集使乳液的表观黏度降低。

2.12乳化活性及乳化稳定性的测定

参考胡淼等(胡淼等，2020)的方法并略修改。AMP溶液(MP浓度为1.5wt％，Arg浓度为0、0.5、1.0、1.5和2.0％)与玉米油以3:1的比例混合，以7000r/min高速均质2min，形成均一的乳液，分别在第0h和第24h吸取乳液的底部溶液50μL，然后加入5mL 0.1％的SDS溶液，旋涡混合器混合。紫外分光光度计500nm波长处测其吸光度。乳化活性及乳化稳定性分别按公式(1)和(2)计算：

式中：T为2.303；N为稀释倍数；C为形成乳液之前的蛋白质质量浓度(g/mL)；θ为乳液的油相体积分数(％)；A

如图12所示，与对照组相比，Arg的添加使AMP乳液的EAI和ESI都明显地提高，且Arg含量在0.5％时存在最大值，Arg的添加增强了蛋白质在油水界面处的吸附，并暴露出了疏水性氨基酸残基，有助于蛋白质在油滴表面的吸附。随着Arg含量的继续增加，AMP的分子的柔性减弱，乳化性能降低。

2.13基于分子对接的Arg与MP作用位点推测

具体操作如下，首先使用ADT赋予配体和蛋白Gasteiger charges，并且合并非极性氢。之后，对蛋白整体结构进行全局搜索获得最佳的配体结合位点。在整个对接过程中，配体的扭转键全部释放。The exhaustiveness parameter参数设置为200个，model number为20个。最后，通过亲和能来考虑配体的最佳对接姿态，并使用PyMOL和ligplot+进行可视化相互作用分析，结果如表1所示。

表1 AMP与参与氢键和疏水接触的氨基酸残基的结合方式和结合能

由表1可知，Arg和MP结合需要的最低结合能量为-5.5kcal/mol，此时AMP复合物的在较低的能量下具有相对稳定的结构和分子构象。Arg的羧基与MP的S204、S153、N200、S203和T197的骨架形成氢键，Arg上的胍基与MP上的K157骨架形成氢键，共形成6个新氢键。同时，在Arg与MP之间的G151、A458、R205、R199、A459、G461和G152发现有7个疏水相互作用力。表明Arg的存在扰乱了MP的原始氢键并导致新氢键的形成，增强MP的疏水作用力，改变了MP的结构构象。

实施例3

1.AMP稳定的Pickering高内相乳液(HIPPEs)的制备

将一定含量的MP和Arg分散在去离子水中，在漩涡振荡处理2min，超声(功率300W)处理15min，获得AMP溶液，再加入不同油相比的玉米油，获得不同Arg(MP＝1.5wt％、油相＝0.68)含量(0.5、1.0、1.5和2.0％)、不同MP(Arg＝0.5％、油相＝0.68)含量(0.5、1.0、1.5和2.0wt％)、不同油相比(MP＝1.5wt％、Arg＝0.5％)(0.70、0.79、0.80、0.81和0.84)的混合物，然后使用具有14mm分散头的均质器以7000rpm将混合物均质2min以制备乳液凝胶。

2.1HIPPEs的表征及流变学行为

HIPPEs的外观由数码相机拍摄。通过光学显微镜对HIPPEs体系的微观结构进行成像。通过激光粒度仪测量HIPPE的液滴尺寸。此外，还利用激光共焦显微镜(CLSM)观察HIPPEs的形态。观察前，尼罗蓝用于蛋白质染色(红色)，尼罗红用于脂质染色(绿色)，染料溶液与乳液凝胶按质量比1：25进行染色，分别在633nm和488nm处激发。HIPPE的流变特性由配备有直径为40mm的平行板的流变仪测定。流动扫描测试用于评估剪切速率为0.1-100s

结果如图13所示，不同Arg含量(0.5、1.0、1.5、2.0％)时(MP＝1.5wt％、油相＝0.68)乳液的外观及光学显微结构，检测结果可知，Arg含量在0.5-1.5％，可形成具有支撑结构的乳液凝胶，倒置时未发生坍塌，Arg含量2.0％，乳液支撑结构减弱，无法倒置。动态粘弹性测定结果表明，乳液凝胶以弹性为主(弹性模量G′＞粘性模量G″)，Arg含量为0.5％时，AMP的乳液性能最佳，随着Arg含量的继续增加，乳化性能降低，弹性模量G′降低，Arg含量为2.0％时，多余的Arg游离于乳液液滴之间，支撑结构减弱。

不同MP含量(0.5、1.0、1.5和2.0wt％)时(Arg＝0.5％、油相＝0.68)乳液的外观及光学显微结构。检测结果可知，MP含量在0.5wt％-2.0wt％均可以形成自我支撑结构的乳液凝胶，倒置未发生坍塌。乳液凝胶以弹性为主，随着MP含量的增加，弹性模量G′增加，在MP含量为1.5wt％达到最高。当MP含量为2.0wt％出现下降，可能是由于多余的MP在体系中充当润滑剂的作用造成。

不同油相比(MP＝1.5wt％、Arg＝0.5％)(0.70、0.79、0.80、0.81、0.84)的乳液的外观及光学显微结构。可知，油相比在0.70-0.81也可形成自我支撑结构的乳液凝胶，且油相比超过0.74，制备乳液凝胶为高内相Pickering乳液。乳液凝胶以弹性为主。随着油相比的增加，弹性模量G′增加，在油相为0.80时达到最高，此时油相与AMP达到了最佳的平衡状态。当油相比为0.81时，弹性模量G′减小，油相比为0.84时，出现破乳现象。

如图14中A所示，使用CLSM进一步观察了HIPPE的界面结构，在Arg含量0.5％、油相0.80时，改变MP的含量依次为0.5、1.0、1.5和2.0wt％，其中油相为蓝色，AMP为红色。可知，形成的HIPPEs属于O/W体系。此外，随着MP含量的增加，HIPPEs中的液滴紧密性增加，出现典型的六边形挤压液滴。图14中B为不同蛋白浓度下HIPPEs体系在去离子水、1.0％SDS、6mol/L尿素中的分散稳定性。可知，HIPPEs体系在去离子水和6mol/L尿素溶液中，经过涡旋处理后，分散性差，说明桥联凝絮作用和氢键作用是体系稳定的主要因素，而在SDS溶液中，不同蛋白浓度下HIPPEs体系的分散性良好，表明疏水相互作用也是稳定体系的主要原因。平均粒径结果(如图14中C所示)也表明，体系在去离子水中的粒径最大，其次为尿素，并且随着蛋白浓度的提升，平均粒径均逐渐增大。但在SDS乳液中，蛋白浓度的增加，对平均粒径的影响要小于去离子水和尿素溶液，可知，蛋白含量的增加对于桥联凝集和氢键作用影响较大。维持HIPPEs体系的稳定的因素有桥联凝絮作用、氢键作用和疏水相互作用。

综上可知，MP含量1.5wt％，Arg＝0.5％，油相比为0.80条件下制备的高内相Pickering乳液具有较高的流变特性，且具有自我支撑结构。

HIPPEs的粘弹性流变结果如图15中A显示，HIPPEs的G′(剪切应变为0.5％，剪切频率为1Hz)随MP含量的增加而上升，在MP＝1.5wt％时，升至最大值。在MP＝2.0wt％时，乳液的G′降低。随着MP含量的增加，HIPPEs体系中存在的桥联结构，氢键作用及疏水相互作用增加，使HIPPEs的网络结构牢固，弹性模量G′增加。但MP含量为2.0wt％时，油滴已经被AMP完成包裹，剩余的MP充斥在油滴间隙间，体系的流动性增强，使体系弹性模量G′减小。

如图15中B所示的频率扫描结果与应变扫描模量变化趋势相似。随着频率扫描的增加模量的增加较为缓慢，体系对频率的依赖性较弱。HIPPEs体系表现出较强的网络结构和凝胶弹性(G′＞G″)。

图15中C显示为HIPPEs在0.1-1000％应变范围内的模量变化趋势(固定频率0.1rad/s)，MP含量的增加体系的线性粘弹区域减少，在低应变幅度下，模量数值基本保持不变，说明其对应变的变化不具备依赖效应。体系主要以弹性为主的凝胶状态(G′＞G″)，且随着MP含量的增加G′增大，这是由于随着MP含量的增加界面聚集效果对乳液弹性网络的贡献增大。当MP含量为2.0wt％时，G′降低，多余的MP未与Arg结合，而是存在于乳液之间，界面凝聚效果降低，乳液弹性网络降低。随着应变幅度的增加，粘性模量(G″，空心)大于弹性模量(G′,实心)，模量曲线迅速下降，进入非线性粘弹区域。HIPPEs体系此时以粘性为主。如表2，γco为G">G'的交叉应变点，γco随着MP含量的增大而增大，说明AMP包裹乳液液滴形成外壳。当MP含量为2.0wt％时，未与Arg结合的多余MP充斥与乳液液滴间，HIPPEs体系抗形变能力增加，γco减小。

表2不同MP浓度制备的HIPPEs的交叉应变值(γco)和流变参数。

注：同列不同小写字母表示组间显著差异(p＜0.05)。

图15中D表观粘度(η

3-ITT为3段剪切速率交替评估HIPPEs体系的触变恢复能力(如图15中E)。在第1阶段和第3阶段的低速剪切速度下(0.1s

2.2HIPPEs的界面蛋白拉曼光谱测定

采用拉曼光谱表征含不同蛋白含量(0.5、1.0、1.5和2.0wt％)的乳液的界面蛋白结构。规格为：532nm激光，40×物镜，激发功率10mW，曝光时间10s，重复20次。使用OMNIC软件对1003cm

如图16中A所示为Arg含量0.5％，油相比0.80时，不同MP含量(0.5、1.0、1.5和2.0wt％)下HIPPEs在500-3500cm

酪氨酸费米共振引起的带化在830cm

图16中C为界面蛋白二硫键的构象变化情况。拉曼光谱中500-550cm

表3HIPPEs在不同MP含量下油水界面蛋白色氨酸残基变化和酪氨酸变化。不同字母表示差异显著(p＜0.05)

注：同列不同小写字母表示组间显著差异(p＜0.05)。

2.3HIPPEs的不同环境的稳定性的测定

HIPPEs在不同环境下的稳定性基于其视觉外观、微观结构、液滴尺寸和流变特性进行了评估。测定离心稳定性：将20g HIPPEs样品转移到离心管中，以12000rpm的速度离心15min，然后用相机记录所有样品的外观。测定热稳定性：在100℃下加热30min，然后快速冷却至25℃。测定冻融稳定性：将样品在-20℃冷冻24h，然后在25℃解冻4h，通过照相机记录所有样品的外观变化。观察pH值对HIPPEs稳定性的影响：将HIPPEs放置于pH值分别为3.0、5.0、7.0、9.0和11.0的溶液体系中观察5天，分别在第0天、第3天和第5天进行外观变化拍摄。观察离子强度对HIPPEs稳定性的影响：将HIPPEs放置于离子强度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mol/L的溶液体系中观察5天，分别在第0天、第3天和第5天进行外观变化拍摄。

图17中A、B为不同pH和离子强度下环境下HIPPEs的环境稳定性试验，可知，在不同的pH(3.0、5.0、7.0、9.0、11.0)溶液环境中，HIPPEs的凝胶形态未发生较大的改变，但在pH9.0、11.0时，第三天开始溶液出现了浑浊现象，第四天时，pH7.0也出现浑浊现象。在不同的NaCl(0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mol/L)溶液环境中，在五天的试验中，未发生明显的浑浊现象。说明HIPPEs体系在酸性环境和NaCl环境中均相对稳定。

冻融稳定性试验可知(如图17中C所示)，HIPPEs冻融处理后，均发生了破乳现象。可能与水相和油相冷冻过程中冰晶形成及热胀冷缩导致的界面复合物脱落有关。

图17中E所示的HIPPEs体系热处理后未出现破乳现象，具有良好的热稳定性。通过对显微微观结构的观察可知，热处理后乳液液滴粒径大小未显著变化，但热处理后HIPPEs体系G′有所降低。原因可能是，热处理使AMP复合物变性，造成体系中桥联凝絮结构、氢键、疏水相互作用等降低，使体系的弹性模量下降。

实施例4

HIPPEs的3D打印应用

AMP稳定的HIPPEs由3D打印机进行打印。将底长20mm、顶长25mm、高10mm的倒棱台几何模型输入打印机，通过尺寸为0.41mm的喷嘴挤压HIPPEs。打印参数：挤压速率为25mm/s，喷嘴缩回速度为20mm/s，打印温度为25℃，填充率为100％，打印层数为15层，打印时间为10min。对打印出来的3D结构进行拍照和记录，计算其打印精度，公式为：

式中，L

3D打印的蒸煮损失和质构分析

在100℃下蒸煮30min后，测定3D打印样品的蒸煮损失率。轻轻擦拭蒸煮样品表面的水，根据蒸煮前的重量(m

蒸煮后，使用质构分析仪和75mm圆盘探针测定3D打印食品样品的质构。以1mm/s的速度将探针垂直压在样品顶部。测试参数如下：样品高度为15mm，触发力为0.2N，应变为30％。硬度、内聚性、弹性、粘性和咀嚼力通过质构分析软件(v1.18)程序进行分析和计算。结果如图18和表4所示。

表4不同Arg浓度的HIPPE的质构特性分析

注：不同字母表明p<0.05时存在显著差异。A表示蒸煮前，B表示蒸煮后。数据表示为平均值±SD(n＝3)。

如图18中A所示，单独由MP稳定的HIPPEs很容易从喷嘴中挤出，由于其机械强度较弱，粘度较低，难以形成完整的“倒棱台”形状，系统完全塌陷，打印精度极低。加入Arg后，HIPPEs的注射性和挤出性显著提高，打印精度也明显提高。其中，含有1.0-2.0％Arg的HIPPEs打印出的“倒棱台”形状存在许多表面不均匀、纹理无组织的缺陷。相比之下，Arg为0.5％的HIPPEs具有结构明确、表面光滑、分辨率高的理想“倒棱台”形状，从俯视图可以看出打印的圆柱体表面非常致密，打印元素分布均匀。AMP中Arg含量的增加促进了3D打印表观质量和分辨率的提高，这可能是由于形成了刚性凝胶网络结构，从而增强了HIPPEs油墨的弹性、固有机械强度和触变性。此外，AMP在油水界面上适当的润湿性可能有利于乳液体系形成较强的自支撑特性，和具有良好的流变性能，这也有利于HIPPEs的打印。

不同Arg含量的3D打印产品的蒸煮损失如图18中C所示。Arg含量对蒸煮损失有显著影响。随着Arg的增加，不同HIPPEs的3D打印产品的蒸煮损失逐渐减小。此外，与对照样品相比，添加Arg可以防止蒸煮过程中的水分流失，对蒸煮稳定性具有良好的保护作用。同时，对以后研究HIPPEs的4D打印产品提供重要的依据。

从表4中可以看出，打印样品的硬度和弹性都受到Arg含量的显著影响。3D打印样品的硬度随着Arg的增加而逐渐增加，这是由于含Arg的HIPPEs具有较高的弹性模量和粘性模量。此外，硬度越高，HIPPEs的微观结构越致密、越硬。硬度提高后的打印试样的自支撑能力提高，不易变形和塌陷。另一方面，AMP形成的网络结构是HIPPEs具有弹性的主要结构。在本研究中，3D打印样品的弹性随着Arg的增加而降低。由于Arg的加入增强了MP分子之间的氢键作用及疏水相互作用，使HIPPEs的网络结构牢固，从而降低了HIPPEs网络的弹性。

综上所述，本发明在超声条件下制备了AMP复合颗粒，其作为稳定剂制备油相80％的HIPPEs。对AMP进行了理化性质表征，研究了HIPPEs的制备条件，通过对微观形态，流变行为、界面蛋白变化、环境稳定性对HIPPEs进行了系统研究。考察了其作为可作为3D打印油墨的可行性。本发明发现：(1)Arg的加入影响MP的交联形态和亲/疏水性及乳化能力，当Arg含量为0.5％，MP含量为1.5wt％时，形成的AMP复合物是一种稳定的Pickering稳定性。(2)AMP复合物制备的HIPPEs体系拥有良好的稳定性、粘弹性及触变恢复能力，具有友好的环境稳定、热处理及离心稳定性。(3)HIPPEs的倒棱台的模型的3D打印证实了其具有良好的挤出性和打印性能，尤其在Arg含量为0.5％时打印精度显著提升。本发明为利用动物性蛋白制备HIPPEs并作为3D打印油墨提供一种新的策略。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。