一种过表达SLC31A1和FDX1的药物及其在治疗肾透明细胞癌中的应用

摘要

本发明公开了一种过表达SLC31A1和FDX1的药物及其在治疗肾透明细胞癌中的应用，涉及生物医疗技术领域。本发明通过在肾透明细胞癌中过表达SLC31A1和FDX1，增强了人肾透明细胞癌对铜离子的敏感性，诱导细胞内铜离子的累积，进而诱导癌细胞发生铜死亡，实现了对肾透明细胞癌的有效治疗，为下一步研制针对肾透明细胞癌的基因药物奠定了基础，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，具体而言，涉及一种过表达SLC31A1和FDX1的药物及其在治疗肾透明细胞癌中的应用。

背景技术

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系统肿瘤中最常见的癌症。2020年全球范围内报道了超过43万例，导致约18万人死亡。其中，肾透明细胞癌(clear cellrenal cell carcinoma，ccRCC)是最常见和最具侵略性的肾癌类型，占所有原发性肾脏肿瘤的75％。由于ccRCC发病相对比较隐匿，有20％-30％的患者在初次诊断时就已经出现肿瘤转移的情况，导致情况进一步恶化。据统计，ccRCC预后较差，中位生存期在6-12个月，5年生存率低于10％。此外，ccRCC对放射治疗和化学治疗普遍不敏感，较难治愈，对患者和社会造成严重负担。

目前针对ccRCC的治疗策略主要包括手术切除、细胞因子疗法、靶向药物治疗和免疫治疗。其中手术切除是局限性肾癌患者的首选治疗方式，但是超过20％的肾透明细胞癌患者在接受手术切除后会发生复发，效果并不理想。对于细胞因子疗法，目前临床上广泛使用的是白细胞介素-2和IFN-α，但是存在毒副作用大等问题。在靶向药物治疗中，索拉菲尼是最早上市用于转移性肾癌的多靶点受体酪氨酸酶抑制剂，通过靶向VEGF、PDGF以及RAF/MEK/ERK等通路抑制肾透明细胞癌的生长，不过对于已经发生转移的肾透明细胞癌患者来说，疗效并不理想。虽然免疫疗法如PD-1抗体能够在一定程度上提高靶向药物的治疗效果，但是目前仍然缺乏足够的临床证据给予支持。

因此，开发特异性针对ccRCC的治疗策略，在降低对正常细胞的毒副作用的同时还要提高治疗效果，仍然是肾透明细胞癌治疗研究中的重点。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种过表达SLC31A1和FDX1的药物及其在治疗肾透明细胞癌中的应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种载体组合，其包括：过表达SLC31A1的重组载体和/或过表达FDX1的重组载体。

第二方面，本发明实施例提供了一种组合物，其包括：前述实施例所述的载体组合。

第三方面，本发明实施例提供了一种药物，其活性成分由前述实施例所述的组合物混合获得。

第四方面，本发明实施例提供了一种药物的制备方法，其包括：将前述实施例所述的组合物混合。

第五方面，本发明实施例提供了过表达SLC31A1的重组载体和/或过表达FDX1的重组载体在制备治疗或辅助治疗肾透明细胞癌的药物中的应用。

第六方面，本发明实施例提供了过表达SLC31A1的重组载体和/或过表达FDX1的重组载体在制备抑制肾透明细胞癌侵袭转移的药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过在肾透明细胞癌中过表达SLC31A1和FDX1，诱导癌细胞发生铜死亡，实现了对肾透明细胞癌的有效治疗，为下一步研制针对肾透明细胞癌的基因药物奠定了基础，具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中使用生物信息学和Western-blot分析和验证SLC31A1和FDX1在正常细胞和肾透明细胞癌中的表达情况；(A-B)SLC31A1和FDX1在正常细胞和肿瘤细胞中的mRNA表达情况；(C)肿瘤中SLC31A1和FDX1的表达关系；(D)Western-blot验证SLC31A1和FDX1在不同细胞中的表达情况；(E-F)FDX1和SLC31A1在正常组织和肿瘤组织中的表达情况；

图2为实施例1中使用生物信息学分析FDX1和SLC31A1对肾透明细胞癌的预后预测能力；

图3为实施例2中基因递送载体的合成路线；

图4为实施例2中基因药物的表征结果；(A-B)基因递送载体负载质粒的能力；(C)不同混合比例下基因药物的粒径大小分布；(D)不同混合比例下基因药物的分散性；(E)不同混合比例下基因药物的zeta电位分布；(F)基因药物的粒径大小；

图5为实施例3中基因药物在(A)肾透明细胞癌786-O和CaKi-1诱导SLC31A1和FDX1过表达的情况以及影响细胞活力；(B)流式细胞仪分析基因药物在肾透明细胞癌786-O和CaKi-1诱导死亡的情况；

图6为实施例3中使用活死染色分析基因药物在肾透明细胞癌786-O和CaKi-1诱导死亡的情况；

图7为实施例3中基因药物在肾透明细胞癌786-O和CaKi-1中(A)影响细胞转移和侵袭能力；(B)影响集落形成能力；(C)影响铜死亡相关蛋白表达的情况；

图8为实施例3中使用不同死亡抑制剂抑制肾透明细胞癌(A)786-O和(B)Caki-1发生铜死亡的能力。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

铜离子是生物体必需的一种微量元素，它的稳态对维持细胞正常生理功能至关重要。一般来说，细胞内铜离子的浓度会受到跨膜蛋白的严格调控，从而维持在较低水平，以防止对细胞造成伤害。但是，当细胞内铜离子浓度超过了维持稳态机制的阈值时，会引发细胞死亡。这种由铜离子超载引发的细胞死亡方式有别于凋亡、焦亡、坏死以及铁死亡，是一种全新的、受调控的、高度依赖铜离子以及线粒体呼吸的细胞死亡方式，因此称作铜死亡。

铜死亡是通过铜离子与三羧酸循环的脂酰化成分直接结合而发生的，这会导致脂酰化蛋白质聚集和随后的铁硫簇蛋白质丢失，从而产生蛋白质毒性应激并且最终诱导细胞死亡。具体来说，一方面，当铜离子在依赖线粒体呼吸的细胞中过度积累时，铜离子与硫锌酰化DLAT结合，诱导DLAT的异聚化。不溶性的异聚化DLAT逐渐增加，会产生细胞毒性，诱导细胞死亡。另一方面，FDX1蛋白会把部分二价铜离子还原成毒性更强的一价铜离子，抑制铁硫簇蛋白的合成，诱导细胞死亡。在铜死亡发生的过程中，SLC31A1和FDX1扮演了重要角色。其中SLC31A1是铜转运跨膜蛋白，主要负责把细胞外的铜离子转运到细胞内。而FDX1是蛋白质脂酰化的上游调节因子，是细胞发生铜死亡的关键蛋白。

铜死亡作为新型的细胞死亡方式，有望开辟新的肿瘤治疗领域，实现更好的肿瘤治疗效果。目前铜死亡相关基因包括FDX1、LIAS、LIPT1、DLD、DLAT、PDHA1、PDHB和SLC31A1。本申请的发明人通过生物信息学分析发现，与正常细胞相比，肾透明细胞癌中FDX1、DLD、DLAT、PDHA1、PDHB和SLC31A1的表达较低，表明肾透明细胞癌可能对铜超载敏感。通过诱导肾透明细胞癌发生铜死亡，在肿瘤治疗领域中有着广阔的前景。进一步的分析发现，在上述六种基因中，只有SLC31A1和FDX1与肾透明细胞癌患者的生存预后显著相关。因此，选择SLC31A1和FDX1作为诱发铜死亡的靶向蛋白。此外，目前尚未有通过靶向SLC31A1和FDX1进而诱发细胞铜死亡的基因药物面世。本申请的发明人通过在肾透明细胞癌中过表达SLC31A1和FDX1，增强了人肾透明细胞癌对铜离子的敏感性，诱导细胞内铜离子的累积，进而诱导癌细胞发生铜死亡，实现了对肾透明细胞癌的有效治疗。为SLC31A1和FDX1调控人肾透明细胞癌发生铜死亡的作用机制、作用效果以及应用前景奠定了基础，为设计以铜死亡为靶点的细胞铜超载治疗提供了依据，具有广阔的应用前景。

具体的技术方案

一方面，本发明实施例提供了一种载体组合，其包括：过表达SLC31A1的重组载体和/或过表达FDX1的重组载体。

本文中的“过表达SLC31A1的重组载体”与“SLC31A1过表达质粒”可相互等同，“过表达FDX1的重组载体”与“FDX1过表达质粒”可相互等同。可以理解的是，过表达SLC31A1的重组载体和/或过表达FDX1的重组载体能够在细胞中表达。

可选地，所述细胞包括人肾透明细胞癌。

所述过表达SLC31A1的重组载体上调人肾透明细胞癌中的高亲和力铜摄取蛋白(SLC31A1)，使得大量铜离子内流到细胞中，提高了铜离子内流，实现铜离子超载。当铜离子在胞内过度积累时，铜离子会与硫辛酰化的二氢硫辛酸转乙酰基酶(DLAT)结合，诱导DLAT的异聚化。不溶性DLAT的增加导致细胞毒性，诱导细胞死亡。所述过表达FDX1的重组载体上调人肾透细胞癌中的线粒体铁氧还蛋白1(FDX1)。FDX1蛋白能够催化低毒性的二价铜离子，转化成高毒性的一价铜离子，可以抑制铁硫簇蛋白的合成，进一步诱导细胞死亡。两种蛋白共同促发细胞发生铜死亡。

在一些实施方式中，所述过表达SLC31A1的重组载体由在表达载体上整合SLC31A1的核苷酸序列后获得，所述过表达FDX1的重组载体由在表达载体上整合FDX1的核苷酸序列后获得。

在一些实施方式中，SLC31A1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在一些实施方式中，FDX1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在一些实施方式中，所述表达载体选自真核表达载体和原核表达载体。

在一些实施方式中，所述表达载体包括pcDNA3.1(+)。

另一方面，本发明实施例提供了一种组合物，其包括：前述任意实施例所述的载体组合。

在一些实施方式中，所述组合物还包括：递送载体。所述递送载体氟化聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和聚(酰胺)树枝状聚合物中的任意一种或多种，具体可以为聚乙烯亚胺(PEI)。

PEI结构中含有氨基，表面富含正电荷，能够通过静电作用与DNA或RNA等表面带有负电荷的核酸类生物大分子结合成复合物，将其压缩成50～200nm的稳定纳米粒结构，这种封闭的结构可有效保护DNA、RNA分子被溶酶体降解。

在一些实施方式中，所述递送载体包括：氟化聚乙烯亚胺。所述氟化聚乙烯亚胺具有较高基因转染能力，能够通过静电相互作用负载基因。

在一些实施方式中，所述载体组合和所述递送载体的质量比为1：(1～30)。该质量比具体可以为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:12、1:14、1:16、1:18、1:20、1:22、1:24、1:26、1:28和1:30中的任意一种或任意两种之间的范围。

在一些实施方式中，所述组合物还包括：透明质酸。进一步包裹透明质酸赋予了药物(基因递送纳米粒子)稳定性和靶向性。

在一些实施方式中，由所述载体组合与所述递送载体组成的组合物与所述透明质酸的质量比为1：(10～100)。该质量比具体可以为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90和1:100中的任意一种或任意两种之间的范围。

在一些实施方式中，所述组合物可以为药物组合物。

在一些实施方式中，所述组合物还可以包括医学上可接受的载体。所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂和吸附载体等。

另一方面，本发明实施例提供了一种药物，其活性成分由前述任意实施例所述的组合物混合获得。

在一些实施方式中，当所述组合物包括递送载体和/或透明质酸时，所述混合的步骤包括：将组分混合后孵育。

另一方面，本发明实施例提供了一种药物的制备方法，其包括：将前述任意实施例所述的组合物混合。

在一些实施方式中，当所述组合物包括递送载体和/或透明质酸时，所述混合的步骤包括：将组分混合后孵育。具体地，当所述组合物包括载体组合和递送载体时，所述制备方法包括：将载体组合和递送载体按照比例(1：1～30)混合孵育。当所述组合物包括载体组合、递送载体和透明质酸时，所述制备方法包括：将载体组合和递送载体按照混合孵育后的产物(基因递送纳米粒子)与透明质酸按照比例(1：10～100)混合孵育。

在一些实施方式中，所述孵育的条件为：温度为室温，时间为5～40min。室温为10～30℃。其中，温度具体可以为10℃、15℃、20℃、25℃和30℃中的任意一种或任意两种之间的范围；时间具体可以为5、10、15、20、25、30、35和40min中的任意一种或任意两种之间的范围。

在一些实施方式中，所述制备方法还包括：递送载体的制备。

在一些实施方式中，当所述递送载体为氟化聚乙烯亚胺时，氟化聚乙烯亚胺的制备包括：合成硫缩酮(TK)中间体；将硫缩酮中间体连接到聚乙烯亚胺(

在一些实施方式中，所述药物的粒径为50～200nm。具体可以为50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm中的任意一种或任意两种之间的范围。

在一些实施方式中，所述药物的zeta电位为-5mV～-40mV，具体可以为-5mV、-10mV、-15mV、-20mV、-25mV、-30mV、-35mV、-40mV中的任意一种或任意两种之间的范围。

另一方面，本发明实施例提供了过表达SLC31A1的重组载体和/或过表达FDX1的重组载体在制备治疗或辅助治疗肾透明细胞癌的药物中的应用。

本发明中的“治疗”包括预防或减轻某种状况，降低某种状况兴起或发展的速度，减少发展出某种状况的风险，预防或延迟与某种状况相关的症状发展，减少或终止与某种状况相关的症状，产生某种状况的完全或部分的逆转，治愈某种状况，或以上的组合。

对于癌症来说，“治疗”可以指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长，繁殖，或转移，或以上的某些组合。对于肿瘤来说，“治疗”包括清除全部或部分的肿瘤，抑制或减缓肿瘤生长和转移，预防或延缓肿瘤的发展，或以上的某些组合。

治疗性的药物或药物组合物的配制及其随后的施用(给药)在本领域技术人员的能力范围内。给药依赖于待治疗的疾病状态的严重度和响应性，治疗的时期持续数天到数月，或直到实现治愈或实现疾病状态的减轻。最佳给药计划可从患者体内药物积累的测量来计算。本领域普通技术人员可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可根据活性成分的相对效力而变化，通常可基于在有效的体外和体内动物模型中有效的EC50来估算。

在一些实施方式中，所述过表达SLC31A1的重组载体和所述过表达FDX1的重组载体同前述任意实施例所述。

此外，本发明实施例还提供了过表达SLC31A1的重组载体和/或过表达FDX1的重组载体在制备抑制肾透明细胞癌侵袭转移的药物中的应用。

在一些实施方式中，所述过表达SLC31A1的重组载体和所述过表达FDX1的重组载体同前述任意实施例所述。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1：利用生物信息学研究SLC31A1和FDX1在正常细胞和肾透明细胞癌细胞中的表达差异

本申请通过广泛而深入的研究，基于铜死亡最重要的两个特征基因(SLC31A1和FDX1)，综合分析了20例肾透明细胞癌患者基因组和正常人基因组的表达数据，并且研究SLC31A1和FDX1对肾透明细胞癌的预后预测能力。

随后使用Western blot实验验证SLC31A1和FDX1在不同细胞上的表达情况。具体来说，首先分别将肾上皮细胞293T、人肾细胞腺癌细胞769-P和ACHN，以及人肾透明细胞癌786-O和Caki-1接种到6孔板中，待细胞增殖铺满孔板后，使用PBS洗涤细胞。每孔加入蛋白裂解液(含1％的PMSF)，置于冰上裂解。接着使用细胞刮刀把裂解后的细胞刮下来，转移至EP管中，再使用超声裂解仪进一步裂解细胞。随后在4℃条件下10000rpm离心，将EP管中上清转移到新的EP管中，使用BCA法测定总蛋白浓度。接着往蛋白样品中加入一定比例的上样缓冲液，放在95℃的金属浴中变性，在4℃条件下10000rpm离心后，取上清转移至新的EP管中，做好标记放入-80℃冰箱中保存。随后使用SDS-PAGE方法进行蛋白电泳。首先将电压设定为100V跑30分钟，待上样蛋白进入下层分离胶后将电压调整到120V，跑70分钟。接着进行转膜，转膜条件为电流0.45A，时间为80分钟。之后根据目的蛋白分子量大小对PVDF膜进行裁剪，并且将PVDF膜转移至脱脂牛奶中，室温条件下摇床封闭1小时后，使用TBST清洗PVDF膜。接着将PVDF膜置于含有目标蛋白抗体的稀释液中，4℃条件下摇床过夜后，按照前述方法进行洗膜。随后取出PVDF膜，将其放到二抗稀释液中，室温下摇床孵育一段时间后，继续按照前述方法洗膜。最后取出PVDF膜，放在显影仪上，加入显影液，显影，定影以及凝胶图像分析。

结果如图1和图2所示。经过生物信息学分析，与正常细胞相比，肾透明细胞癌中的FDX1和SLC31A1低表达(图1中A-B)。此外，FDX1和SLC31A1的表达呈正相关(图1中C)。Western blot实验结果证实，FDX1和SLC31A1在正常的肾上皮细胞293T中高表达，在肾脏肿瘤细胞(人肾细胞腺癌细胞769-P和ACHN，以及人肾透明细胞癌786-O和Caki-1)均低表达(图1中D)。分析组织切片数据库，也同样证实FDX1和SLC31A1在肾脏正常组织中高表达，在肾脏肿瘤组织中低表达(图1中E)。FDX1与SLC31A1与临床分期明显相关(图2中A)，生存分析表明在肾透明细胞癌患者中，FDX1与SLC31A1表达越高，患者预后越好(图2中B和C)。此外，FDX1与SLC31A1均可作为肾透明细胞癌的独立预测因子(图2中D-F)。

实施例2：基因药物的制备和表征

本实施例中以SLC31A1和FDX1过表达质粒作为治疗基因，氟化聚乙烯亚胺

2.1SLC31A1和FDX1过表达质粒的构建

SLC31A1过表达质粒和FDX1过表达质粒订购自上海吉玛制药技术有限公司。

SLC31A1的核苷酸序列(SEQ ID No.1)如下：

5’-ATGGATCATTCCCACCATATGGGGATGAGCTATATGGACTCCAA CAGTACCATGCAACCTTCTCACCATCACCCAACCACTTCAGCCTCACACTCCCATGGTGGAGGAGACAGCAGCATGATGATGATGCCTATGACCTTCTACTTTGGCTTTAAGAATGTGGAACTACTGTTTTCCGGTTTGGTGATCAATACAGCTGGAGAAATGGCTGGAGCTTTTGTGGCAGTGTTTTTACTAGCAATGTTCTATGAAGGACTCAAGATAGCCCGAGAGAGCCTGCTGCGTAAGTCACAAGTCAGCATTCGCTACAATTCCATGCCTGTCCCAGGACCAAATGGAACCATCCTTATGGAGACACACAAAACTGTTGGGCAACAGATGCTGAGCTTTCCTCACCTCCTGCAAACAGTGCTGCACATCATCCAGGTGGTCATAAGCTACTTCCTCATGCTCATCTTCATGACCTACAACGGGTACCTCTGCATTGCAGTAGCAGCAGGGGCCGGTACAGGATACTTCCTCTTCAGCTGGAAGAAGGCAGTGGTAGTGGATATCACAGAGCATTGCCATTGA-3’；

FDX1的核苷酸序列(SEQ ID No.2)如下：

5’-ATGGCTGCCGCTGGGGGCGCCCGGCTGCTGCGCGCCGCTTCT GCTGTCCTCGGCGGCCCGGCCGGCCGGTGGCTGCACCACGCTGGGTCCCGCGCTGGATCCAGCGGCCTGCTGAGGAACCGGGGGCCGGGCGGGAGCGCGGAGGCGAGCCGGTCGCTGAGCGTGTCGGCGCGGGCCCGGAGCAGCTCAGAAGATAAAATAACAGTCCACTTTATAAACCGTGATGGTGAAACATTAACAACCAAAGGAAAAGTTGGTGATTCTCTGCTAGATGTTGTGGTTGAAAATAATCTAGATATTGATGGCTTTGGTGCATGTGAGGGAACCCTGGCTTGTTCAACCTGTCACCTCATCTTTGAAGATCACATATATGAGAAGTTAGATGCAATCACTGATGAGGAGAATGACATGCTCGATCTGGCATATGGACTAACAGACAGATCACGGTTGGGCTGCCAAATCTGTTTGACAAAATCTATGGACAATATGACTGTTCGAGTGCCTGAAACAGTGGCTGATGCCAGACAATCCATTGATGTGGGCAAGACCTCCTGA-3’。

2.2基因递送载体的构建

首先合成硫缩酮(TK)中间体。3-巯基丙酸与无水丙酮在饱和的干燥氯化氢气体和室温条件下混合搅拌。接着混合物在冰盐混合物中冷却，完全结晶。过滤收集结晶，依次用己烷和冷的去离子水洗涤，在真空干燥器中干燥得到硫缩酮(TK)中间体。随后合成氟化聚乙烯亚胺基因递送载体。硫缩酮、EDCI和NHS溶解在无水甲醇中活化，接着把PEI 1.8K溶解在无水甲醇中，再缓慢滴加到前述混合物中，室温下搅拌反应24小时。随后，把七氟丁酸酐溶解在无水甲醇中后，缓慢滴加到前述混合液中，并且再加入三乙胺，室温搅拌24小时。最后，把混合液转移到透析袋中，在去离子水中透析3天后，经过冷冻干燥获得基因递送载体

2.3基因药物的制备与表征

首先使用DNA凝胶电泳研究基因载体负载质粒的能力。称取琼脂糖溶解在TAE(1X)溶液中，微波炉加热溶解。待溶液冷却至50℃左右时，加入GelRed核酸染色液(10000X)，摇晃均匀，倒入模具中，插上梳子。此时，把质粒与基因递送载体按照质量比1:1～1:30在室温中孵育一段时间后，与Loading buffer混合，上样。DNA凝胶电泳条件为：电压150V，时间20分钟。结束后，把凝胶放置到显影仪中观察。如图4中A，游离的质粒能够在凝胶上显示出条带，但是与不同比例的基因递送载体混合后，无法显示条带。这是因为带负电的质粒与带正电的氟化聚乙烯亚胺紧密结合，整体带正电，无法在凝胶上显示出条带，表明基因递送载体氟化聚乙烯亚胺具有优良的质粒负载能力。

随后考察透明质酸修饰后是否会影响基因载体负载质粒的能力。把质粒与基因递送载体混合20min后，按照质粒与透明质酸按照质量比1:10～1:100混合孵育20min后，与Loading buffer混合，上样。DNA凝胶电泳条件为：电压150V，时间20分钟。结束后，把凝胶放置到显影仪中观察。如图4中B，透明质酸并不会影响基因递送载体负载质粒的能力。

接着通过流体动力学直径(Size)和多分散指数(PDI)筛选合适的合成比例。把质粒与基因递送载体混合一段时间后，按照质粒与透明质酸质量比1:10-1:100混合孵育一段时间。反应结束后，使用马尔文粒径仪测定上述反应混合溶液的流体动力学直径、多分散指数和zeta电位。结果如图4所示。当质粒、基因递送载体和透明质酸之间的质量比为1:10:30时，所得基因药物

实施例3：基因药物

3.1基因药物

首先研究基因药物

接着研究基因药物

随后使用流式细胞仪分析药物处理后细胞死亡情况。两种肾透明细胞癌786-O和Caki-1接种到24孔板中，待细胞增殖24小时后，往两种细胞中加入无功能质粒(Vector)、SLC31A1 OE、FDX1 OE和(FD+SLC)OE，孵育48小时后，收集上清，使用PBS清洗一次。接着加入胰酶消化细胞，与收集的上清混合一起后，使用碧云天生物公司的Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒进行分析。使用流式细胞仪分析处理好的细胞，结果如图5中B所示，所有经过质粒处理的细胞都没有出现凋亡的情况，尽管它们的活力都受到了抑制，这表明SLC31A1和FDX1过表达质粒可能不会通过线粒体途径诱导细胞凋亡。

3.2基因药物

两种肾透明细胞癌786-O和Caki-1接种到24孔板中，待细胞增殖24小时后，往两种细胞中加入无功能质粒(Vector)、SLC31A1 OE、FDX1 OE和(FD+SLC)OE，孵育48小时后，使用碧云天公司的Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒处理细胞。随后使用荧光显微镜观察细胞死亡情况。如图6所示，单独使用SLC31A1或者FDX1过表达质粒处理细胞，经染料染色后，可观察出现部分红色荧光，表明单独使用任意一种过表达质粒，能够在一定程度上诱导细胞死亡。然而，当同时递送两种过表达质粒时，经染料染色后，可观察到大量红色荧光，表明同时过表达SLC31A1和FDX1可以显著诱导细胞死亡。

3.3基因药物

首先研究基因药物

接着研究基因药物

最后研究研究基因药物

3.4铜螯合剂TTM能够逆转基因药物

为了更直观证明基因药物

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。