基于毛细管凝胶电泳技术的核酸适配体荧光传感检测方法

摘要

本发明公开了一种基于毛细管凝胶电泳技术的核酸适配体荧光传感检测方法，通过选择可以与雌二醇特异性结合的核酸单链适配体，在适配体5’端进行荧光标记修饰，利用适配体与靶标结合后电泳速率的改变，实现雌二醇的检测。本发明方法只采用单链核酸适配体进行靶标的检测，避免了互补链对检测系统的干扰，以及对核酸适配体结合效率的影响。另外，本发明使用的核酸适配体不需要引入互补链，核酸适配体与靶标一对一稳定结合，不会因互补链改变核酸适配体的空间结构。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于毛细管凝胶电泳技术的核酸适配体荧光传感检测方法。

背景技术

核酸适配体作为一种新兴的技术手段，使核酸通过构象转变与靶标结合，因此利用核酸的检测手段即可实现靶标的鉴定。利用核酸适配体技术可以实现食品安全检查。

当前，核酸适配体技术主要有如下两种：

1)利用核酸适配体互补链，实现靶标的荧光传感：选择可以与靶标特异性结合的DNA单链作为适配体，并设计多条与适配体配对强度各异的互补链，利用荧光染料与双链DNA的特性结合进行检测。当加入靶标时，靶标和适配体互补链竞争与适配体结合，互补链被释放，被随后加入的核酸外切酶I(Exonuclease I)全部剪切。接着，利用双链特异性荧光染料对DNA浓度进行报告检测，得到靶标浓度与荧光强度的关系并定量分析。

2)基于金纳米复合材料和多肽构建的核酸适配体荧光传感器对靶标进行检测：利用未经荧光修饰的适配体链与复合材料共价固定，在加入具有防污性能的多肽消除生物污损等背景的作用下，与靶标结合后，引入携带荧光的核酸适配体链，形成类似于“三明治”结构的传感平台。

然而，方案1)中核酸互补链会与靶标形成竞争关系。荧光结合在互补链上，检测的是核酸互补链的荧光信号，不能直接反映靶标的信号。互补链对检测系统的干扰，影响核酸适配体与靶标的结合效率。方案2)中需要引入多肽分子，会改变核酸适配体的空间结构，影响核酸适配体与靶标的结合效率。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种基于毛细管凝胶电泳技术的核酸适配体荧光传感检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于毛细管凝胶电泳技术的核酸适配体荧光传感检测方法，具体过程为：

S1、准备核酸适配体；所述核酸适配体的序列为：

5’FAM-CGAAGCGCTAGAACATGGCACGTGACGGGGGATCTGGGATACCTGGCGGATCCGTGTAGTACATGAGACTTAGCTGATCCTGATGG-3’

5’端采用FAM标记；

S2、制备雌二醇溶液：先用纯甲醇溶解制备得到1mg/ml的雌二醇溶液，再采用Tris-HCl缓冲液稀释所述雌二醇溶液至目标浓度；于4℃冰箱备用；

S3、制备适配体与雌二醇的结合缓冲液；

S4、适配体和雌二醇的结合：向步骤S2所得的雌二醇溶液中加入核酸适配体溶液和结合缓冲液，于室温避光孵育，将样品稀释到目标浓度后，上样，采用毛细管凝胶电泳法进行雌二醇检测。

进一步地，步骤S2中，Tris-HCl缓冲液中包含100mmol/L Tris-HCl、200mmol/LNaCl、25mmol/L KCl、10mmol/L MgCl

进一步地，步骤S3中，所述结合缓冲液包括20mmol/L Tris、1mol/L NaCl和10mol/L MgCl

进一步地，步骤S4的具体过程为：向50ul 100ng/ml雌二醇溶液中加入50ul 1μmol/L的核酸适配体溶液以及50ul结合缓冲液，于室温避光孵育20分钟，将样品稀释到合适浓度后，取1ul上样，采用毛细管凝胶电泳法进行雌二醇检测。

本发明的有益效果在于：本发明方法通过选择可以与雌二醇特异性结合的核酸单链适配体，在适配体5’端进行荧光标记修饰，利用适配体与靶标结合后电泳速率的改变，实现雌二醇的检测。当加入雌二醇时，靶标与适配体特异结合，在毛细管凝胶电泳的条件下，适配体-雌二醇复合物的电泳速率小于适配体的电泳速率。由于适配体5’端有荧光标记，当荧光物质被激光激发后，产生特征的荧光峰，通过对荧光峰的峰面积和峰型变化，实现雌二醇的检测。

本发明方法只采用单链核酸适配体进行靶标的检测，避免了互补链对检测系统的干扰，以及对核酸适配体结合效率的影响。另外，本发明使用的核酸适配体不需要引入多肽分子，核酸适配体与靶标一对一稳定结合，不会因多肽物质改变核酸适配体的空间结构。

附图说明

图1为本发明实施例2中结合缓冲液的优化的实验结果示意图；

图2为本发明实施例2中结合时间优化的实验结果示意图；

图3为本发明实施例2中适配体浓度优化的实验结果示意图；

图4为本发明实施例3中灵敏度测试的实验结果示意图；

图5为本发明实施例3中特异性测试的实验结果示意图。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

实施例1

本实施例提供一种基于毛细管凝胶电泳技术的核酸适配体荧光传感检测方法，具体过程为：

S1、准备核酸适配体；所述核酸适配体的序列为：

5’FAM-CGAAGCGCTAGAACATGGCACGTGACGGGGGATCTGGGATACCTGGCGGATCCGTGTAGTACATGAGACTTAGCTGATCCTGATGG-3’

5’端采用FAM标记；

S2、制备标准物质溶液：先用纯甲醇溶解制备得到1mg/ml的雌二醇标准储备溶液，再采用Tris-HCl缓冲液(100mmol/L Tris-HCl、200mmol/L NaCl,25mmol/L KCl、10mmol/LMgCl

S3、制备适配体与雌二醇的结合缓冲液，所述结合缓冲液包括20mmol/L Tris、1mol/L NaCl和10mol/L MgCl

S4、适配体和雌二醇的结合：向50ul 100ng/ml雌二醇标准溶液中加入50ul 1μmol/L的适配体溶液以及50ul结合缓冲液，于室温避光孵育20分钟，将样品稀释到合适浓度后，取1ul上样，采用毛细管凝胶电泳法进行检测。

实施例2

本实施例旨在通过实验说明实施例1中的结合缓冲液、结合时间、结合缓冲液浓度的优化。

(1)结合缓冲液的优化。

目前文献报道已经筛选出来的适配体有千余种，核酸适配体容易出现重现性不好、与靶标的亲和力不高等问题，究其原因是缓冲液的pH值等因素影响适配体的二级构象、适配体与靶标的亲和力、适配体的自我折叠构象以及适配体与靶标形成复合物的空间构象稳定性，最终影响适配体与靶标的结合效率。本实施例依据雌二醇的筛选适配体缓冲液并结合相关适配体的研究基础，针对pH值设计了3种缓冲液进行对比优化，分别是：

缓冲液1：pH4.4，10mM柠檬酸钠缓冲液,1M NaCl,10mM MgCl

缓冲液2：pH7.4，20mm Tris,1M NaCl,10mM MgCl

缓冲液3：pH9.0，20mm Tris,1M NaCl,10mM MgCl

分别取缓冲液1、2、3各50ul，向其中加入50ul 100ng/ml的雌二醇标准溶液和50ul1μmol/L的核酸适配体，室温避光孵育30min，将样品稀释到合适浓度后，取1ul上样。检测结果如图1所示。图1中从左往右依次对应缓冲液1、缓冲液2和缓冲液3。

参考毛细管区带电泳筛选核酸适配体的方法，将未结合靶标的适配体峰面积设为I

(2)适配体和雌二醇结合时间的优化

向50ul 100ng/ml雌二醇标准溶液中加入50ul 1uM FAM标记的适配体溶液以及50ul结合缓冲液，分别于室温避光孵育10min，20min，30min，60min。将样品稀释到合适浓度后，取1ul上样，结果如图2所示。图2中，从左往右依次对应10min、20min、30min、60min的实验结果。

经检测，10分钟时，适配体和雌二醇尚未有效结合；20分钟时，适配体与雌二醇结合；在延长结合时间后，检测峰型未发生变化。4个时间的(I

(3)适配体浓度的优化

由于毛细管凝胶电泳采用荧光激发技术，检测灵敏度极高，当适配体浓度过高时，容易引起峰值溢出导致检测失败；但适配体浓度过低，又会影响对靶标的检测，因此项目组对适配体的浓度进行了优化。

分别配制10uM、1uM、0.1uM、0.01uM、0.001uM的核酸适配体溶液，各取50ul后，加入50ul 100ng/ml雌二醇标准溶液以及50ul结合缓冲液，采用优化的实验条件，对检测结果进行测试，如图3所示。图3中，从左往右依次对应10uM、1uM、0.1uM、0.01uM、0.001uM的实验结果。

结果显示，当核酸适配体浓度为10uM时，适配体虽然与靶标结合，但是由于浓度过高，超出设备的荧光检测范围，不能有效收集荧光信号，无法实现靶标的检测；当核酸适配体浓度为1uM时，可以检测到适配体-靶标复合物的有效峰；当核酸适配体浓度降低到0.1uM后，无法有效判断适配体-靶标复合物的有效峰，随着浓度降低，峰值逐渐降低，无法实现对靶标的检测。各浓度下(I

实施例3

本实施例旨在通过实验验证实施例1所述方法的实施效果。

(1)灵敏度实验

对不同浓度的雌二醇进行检测。配制0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml的雌二醇样品各50ul，分别加入50ul1uM FAM标记的适配体溶液以及50ul结合缓冲液，于室温避光孵育20min。将样品稀释到合适浓度后，取1ul上样。检测结果如图4所示，当靶标浓度达到0.1ng/ml时，可以检测到雌二醇。因此检测最低灵敏度为0.1ng/ml。图4中，从左到右依次对应的雌二醇浓度为0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml。

(2)特异性实验

取100ng/ml雌二醇、三羟基氨基甲烷、雌三醇、孕酮、双酚A溶液各50ul，分别向以上溶液中加入50ul 1uM适配体和50ul结合缓冲液，于室温孵育20min。将样品稀释到合适浓度后，取1ul上样，检测结果如图5所示。(I

对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。