基于EXOⅢ酶的荧光信号放大探针的高灵敏基因检测及凝胶电泳技术筛选细胞核酸适配体

摘要

本文对信号放大技术及其在基因检测方面的应用作了相关研究。首先，用活化的PAA（MW=8000）交联Fe3O4磁性纳米粒制得表面带有活化羧基的Fe3O4磁珠。利用氨基-羧基反应将氨基化的荧光核酸探针固定在 Fe3O4磁珠表面，制备了荧光核酸探针-Fe3O4磁珠复合物。Fe3O4磁珠不仅能够作为分离载体，还能够有效淬灭荧光核酸探针上的荧光基团，降低了背景荧光信号，为后续荧光信号放大奠定了基础。在加入待测靶分子后，靶分子与荧光核酸探针通过碱基互补形成双链，利用核酸外切酶EXOⅢ独特的水解特性，使得EXOⅢ水解探针并释放出靶分子和荧光信号。靶分子继续和过量的荧光核酸探针杂交，使EXOⅢ继续水解释放靶分子和荧光信号，这样荧光信号得到显著放大，建立了基于EXOⅢ辅助的循环信号放大的DNA检测体系。与传统的分子信标方法相比，该方法灵敏度更高，荧光信号放大能力更为显著。此外，将双荧光标记的荧光探针混合，能够通过荧光检测信号的不同对基因 SNP进行快速分型。近年来，越来越多的核酸探针应用于识别和捕获检测癌细胞，用于癌症的早期诊断和治疗。核酸适配体是一种单链DNA/RNA探针，类似抗体，能够作为分子探针广泛应用于分子生物医学领域。
　　本研究基于琼脂糖凝胶电泳技术，结合基于细胞的指数富集的配体系统进化技术（Cell-SELEX），对完整的靶细胞进行核酸适体筛选。以急性早幼粒细胞白血病细胞HL-60为靶细胞，将靶细胞固定于琼脂糖凝胶中，通过电泳过程中ssDNA与靶细胞的亲和力不同而导致的电泳迁移率不同，分离出强特异性的核酸适体。通过对电泳、PCR等条件的优化，经5轮筛选从原始随机ssDNA文库中初步筛选出了对HL-60细胞特异性结合的核酸适体。

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序言

1. 信号放大技术

1.1 信号放大技术概述

1.2 基于核酸外切酶辅助的靶分子循环信号放大技术

1.3基于核酸外切酶辅助的靶分子循环信号放大技术在基因检测中的应用

2. 核酸适配体的筛选

2.1核酸适配体概述

2.2核酸适体的筛选方法

2.3核酸适体的应用

3. 本文的立题思想和研究内容

第一部分 荧光信号放大探针在基因检测中的应用

第一章 基于EXOⅢ酶的荧光信号放大探针的SNP基因分型及定量测定

1. 引言

2. 实验

3. 结果与讨论

第二部分 细胞核酸适配体筛选

第二章 建立基于琼脂糖凝胶电泳的HL-60细胞适体筛选方法

1. 引言

2．实验

3. 结果与讨论

4．小结

第三章 单链次级文库的制备

1. 引言

2. 实验

3. 结果与讨论

4. 小结

第四章 基于琼脂糖凝胶电泳的HL-60细胞适配体筛选

1. 引言

2. 实验

3. 结果与讨论

4. 小结

结论与展望

参考文献

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

致谢