一种用于提高三阴性乳腺癌免疫治疗效果的复合纳米粒及其应用

摘要

本发明公开了一种用于提高三阴性乳腺癌免疫治疗效果的复合纳米粒及其应用，通过构建以环糊精改性聚(β‑氨基酯)(CD‑PBAE)为核心的复合纳米粒，用于高效共递送PD‑L1特异性靶向dCas9‑KRAB CRISPRi系统和BET抑制剂JQ1。该复合纳米粒能够在4T1细胞中特异性地对目的基因PD‑L1进行靶向下调其表达；在小鼠乳腺癌模型中瘤内给药结果证明该复合纳米粒能够有效解除免疫检查点抑制，实现肿瘤免疫微环境的重塑，达到增强抗肿瘤免疫治疗的作用。本发明提出了将基因编辑与表观遗传药物联合用于三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫治疗的新理念，为临床前期肿瘤免疫治疗及未来转化医学的发展提供了有价值的参考。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种用于提高三阴性乳腺癌免疫治疗效果的复合纳米粒及其应用，具体涉及一种共递送PD-L1特异性靶向CRISPR/dCas9-KRAB质粒和BET抑制剂JQ1的复合纳米粒在三阴性乳腺癌免疫治疗中的应用。

背景技术

三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌的一种亚型，被定义为雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)表达。与乳腺癌的其他亚型相比，TNBC更容易复发和转移，存活率更低。由于缺乏明确的目标，在过去几十年里，新的治疗干预措施有限，化疗仍然是主要的治疗方法。随着实体瘤免疫检查点抑制(ICI)的发展和TNBC免疫原性的验证，免疫治疗越来越受到关注。

基因编辑的发展在肿瘤免疫治疗研究中显示出广泛的应用前景，也为免疫检查点的抑制和阻断提供了一种新的方法。与CRISPR基因编辑技术不同，dCas9-KRAB CRISPRi系统可通过转录抑制获得高水平的基因抑制效果且不会改变靶基因位点基因序列，从而在一定程度上能够减少脱靶效应带来的损害。通过dCas9-KRAB CRISPRi系统下调肿瘤细胞表面PD-L1表达水平，可增强机体抗肿瘤免疫效应，同时减少对自身组织的损伤以及克服免疫检查点抑制剂的适应性耐药，将会具有十分重要的临床治疗意义。

溴结构域和额外末端结构域(BET)抑制剂JQ1可通过阻断BET家族成员BRD4与组蛋白的乙酰化赖氨酸残基的结合，调控Pol II指导的相关转录从而影响BRD4靶基因PD-L1的表达，达到增强抗肿瘤免疫的效果。然而由于BET抑制剂单药应用疗效普遍较弱，且容易产生快速耐药，将BET抑制剂与dCas9-KRAB CRISPRi系统基因治疗联合应用将为三阴性乳腺癌的临床治疗提供新的策略。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：本发明的目的是提供一种用于提高三阴性乳腺癌免疫治疗效果的复合纳米粒。通过构建一种环糊精改性聚(β-氨基酯)(CD-PBAE)，用于共递送PD-L1特异性靶向CRISPR/dCas9-KRAB质粒和BET抑制剂JQ1，形成复合纳米粒。该复合纳米粒能够特异性地对目的基因PD-L1进行靶向下调其表达，解除免疫检查点抑制，从而实现肿瘤免疫微环境的重塑，达到增强抗肿瘤免疫治疗的作用。

本发明的技术方案为：一种用于提高三阴性乳腺癌免疫治疗效果的复合纳米粒，包括含PD-L1基因特异性靶向sgRNA的CRISPR/dCas9-KRAB质粒、环糊精改性聚(β-氨基酯)、JQ1与金刚烷乙酸通过双硫键连接形成的前药AD-SS-JQ1，其中，前药AD-SS-JQ1包封至环糊精改性聚(β-氨基酯)的腔隙中形成阳离子聚合物包合物，阳离子聚合物包合物与含PD-L1基因特异性靶向sgRNA的CRISPR/dCas9-KRAB质粒经电荷吸附作用形成复合纳米粒。

进一步地，所述含PD-L1基因特异性靶向sgRNA的CRISPR/dCas9-KRAB质粒中编码sgRNA的DNA序列的正义链和反义链分别如SEQ ID No.1(5’GTTATCTCATAGTATTTCC TG3’)和SEQ ID No.2所示(5’CAGGAAATACTATGAGATAAC3’)。

进一步地，所述含PD-L1基因特异性靶向sgRNA的CRISPR/dCas9-KRAB质粒的载体质粒为pLvhU6-sgRNA hUbc-dCas9-KRAB-T2a-GFP。

进一步地，所述环糊精改性聚(β-氨基酯)通过以下方法得到：1，4-丁二醇二丙烯酸、5-氨基-1-戊醇、6-氨基环糊精通过经典迈克尔反应聚合得到环糊精改性聚(β-氨基酯)。

进一步地，所述JQ1与金刚烷乙酸通过双硫键连接形成的前药AD-SS-JQ1通过以下方法得到：通过胱胺为连接子，用双硫键SS将JQ1与金刚烷乙酸连接形成前药AD-SS-JQ1。

进一步地，所述PD-L1基因特异性靶向sgRNA的CRISPR/dCas9-KRAB质粒、环糊精改性聚(β-氨基酯)、JQ1与金刚烷乙酸通过双硫键连接形成的前药AD-SS-JQ1的质量比为1∶80∶0.1。

本发明还公开了一种上述所述复合纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)构建含PD-L1基因特异性靶向sgRNA的CRISPR/dCas9-KRAB质粒：在PD-L1基因序列的上游启动子和5’UTR区域设计多条sgRNA并将靶点基因序列克隆进入CRISPR/dCas9-KRAB质粒中，经过测序验证序列准确性后可进行细胞转染，筛选出靶向调控效率高的质粒；

(2)合成环糊精改性聚(β-氨基酯)：1，4-丁二醇二丙烯酸、5-氨基-1-戊醇、6-氨基环糊精通过经典迈克尔反应聚合得到环糊精改性聚(β-氨基酯)；

(3)合成前药AD-SS-JQ1：通过胱胺为连接子，用双硫键将JQ1与金刚烷乙酸连接形成前药AD-SS-JQ1；

(4)制备复合纳米粒：将环糊精改性聚(β-氨基酯)与前药AD-SS-JQ1共同溶解于二甲基亚砜，孵育形成阳离子聚合物包合物，将阳离子聚合物包合物与含PD-L1特异性靶向sgRNA的CRISPR/dCas9-KRAB质粒在缓冲液中室温孵育，形成复合纳米粒。

进一步地，步骤(1)所述构建含PD-L1基因特异性靶向sgRNA的CRISPR/dCas9-KRAB质粒的方法为：以pLvhU6-sgRNA hUbc-dCas9-KRAB-T2a-GFP质粒为载体，用BsmbI限制性内切酶进行酶切，得到线性化的质粒载体，将合成的编码sgRNA的DNA克隆到线性化质粒载体中，然后连接形成环状质粒，所述DNA的正义链和反义链分别如SEQ ID No.3(5’CACCGTTATCTCATAGTATTTCCTG3’)和SEQ ID No.4(5’AAACCAGGAAATACT ATGAGATAAC3’)所示。

进一步地，步骤(2)所述合成环糊精改性聚(β-氨基酯)的方法为：以摩尔计，称取10份1，4-丁二醇二丙烯酸、6-9份5-氨基-1-戊醇、1-4份6-氨基环糊精，用一定体积无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，在70℃下反应36-96小时，冷却至室温，加入0.05-0.2份1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪，反应24-96h后将反应液滴入5-10倍体积无水乙醚，离心后取沉淀真空干燥即得。

进一步地，步骤(3)所述合成前药AD-SS-JQ1的方法为：以摩尔计，将1份JQ1、1.5份1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和1.5份N-羟基丁二酰亚胺在无水二甲基亚砜反应6-12h后加入3份胱胺，继续反应36-96h，纯化后得中间产物；1份金刚烷乙酸与1.5份1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和1.5份N-羟基丁二酰亚胺在无水二甲基亚砜反应6-12h后，加入1份中间产物，继续反应36-96h，层析柱分离得到前药AD-SS-JQ1。

进一步地，步骤(4)所述制备复合纳米粒的方法为：以摩尔计，将10份环糊精改性聚(β-氨基酯)与1份前药AD-SS-JQ1共同溶解于DMSO，孵育，形成阳离子聚合物包合物，将阳离子聚合物包合物与含PD-L1特异性靶向sgRNA的CRISPR/dCas9-KRAB质粒按50-80:1的质量比在pH5.2的缓冲液中室温孵育30分钟，形成复合纳米粒。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的目的在于提供一种用于提高三阴性乳腺癌免疫治疗效果的复合纳米粒，将PD-L1特异性靶向的CRISPRi系统与BET抑制剂联合应用，该联合疗法能协同下调肿瘤细胞PD-L1表达，增强T细胞免疫，解除免疫抑制性微环境，达到增强抗肿瘤免疫的效应。

(2)运用dCas9-KRAB CRISPRi系统可以对目的基因进行精准定位调控而不造成DNA损伤，从而在一定程度上能够减少脱靶效应带来的损害；其次，dCas9-KRAB相对于dCas9对目的基因转录调控的能力更加强而有力；此外，dCas9-KRAB对细胞生长没有影响，使其成为无毒的基因沉默方法。

(3)与单抗药物相比，通过基因编辑技术下调肿瘤细胞表面PD-L1表达水平具有更强的特异性和持续性，不仅能增强机体抗肿瘤免疫效应，同时减少对自身组织的的损伤以及克服免疫检查点抑制剂的适应性耐药，为运用分子疗法作为减少PD-L1抑制剂副作用的替代疗法打开了大门。

(4)表观遗传改变在肿瘤免疫中起着重要作用。BET抑制剂可以有效地抑制PD-L1的表达，在实体瘤中表现出了良好的抗癌作用。将基因编辑技术与BET抑制剂JQ1治疗联合，能促进PD-L1表达下调后的免疫治疗效果，起到“1+1>2”的协同治疗作用。

(5)以环糊精改性聚(β-氨基酯)(CD-PBAE)为核心的纳米粒可以实现CRISPRi系统的肿瘤细胞高转染率、BET抑制剂JQ1的药物高转载率、良好的生物相容性和肿瘤组织的有效富集，实现了免疫检查点阻断和肿瘤微环境重塑，提出了将基因编辑与表观遗传药物联合用于抗肿瘤免疫治疗的新理念，为三阴性乳腺癌的临床治疗提供了新的思路。

附图说明

图1和图2分别为不同浓度的JQ1对4T1细胞PD-L1表达水平影响的流式检测结果图和定量分析图。

图3、图4、图5分别为含不同sgRNA的CRISPR/dCas9-KRAB质粒在4T1细胞中靶向PD-L1调控效率的流式分析图、RT-qPCR结果图和Western Blot图。

图6为阳离子聚合物CD-PBAE的核磁分析图。

图7为前药AD-SS-JQ1的核磁分析图。

图8为复合纳米粒JQ1@CPP的粒径、电位和TEM图。

图9和图10为不同复合纳米粒在4T1细胞中靶向PD-L1调控效率的RT-qPCR结果图和流式分析图。

图11、图12分别为不同复合纳米粒在小鼠乳腺癌动物模型中的生长曲线图以及瘤重变化图。

图13为经不同复合纳米粒治疗后小鼠肿瘤组织PD-L1调控效率的RT-qPCR结果图。

图14、图15为经不同复合纳米粒治疗后小鼠肿瘤组织PD-L1、TUNEL免疫组化分析图。

图16为经不同复合纳米粒治疗后小鼠体内各主要脏器切片的HE染色图。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

本发明提供一种用于提高三阴性乳腺癌免疫治疗效果的复合纳米粒。

第一步，检测BET抑制剂JQ1药物对PD-L1的作用效果。

将4T1细胞和提前用IFN-γ(20ng/mL)预处理24小时的4T1细胞分别接种至六孔板培养。用PBS将JQ1稀释至不同浓度，包括50nM、200nM、500nM、1μM和5μM，分别给予4T1细胞和预处理的4T1细胞，药物作用48小时后，细胞用2.5g/L胰蛋白酶溶液消化，500r/min离心收集细胞，用PBS洗涤2次后制成PBS单细胞悬液，加流式抗体PD-L1-PE染色液室温作用30分钟，用流式细胞仪测定PD-L1的表达。实验按相同操作重复三遍。如图1和图2所示，经过不同浓度JQ1处理后的4T1细胞，其PD-L1表达水平随着药物作用浓度增加呈减少趋势。当JQ1浓度为200nM时，PD-L1表达下调约为对照组的50％。给予IFN-γ预处理的4T1细胞其PD-L1表达水平较对照组明显提高，但经过JQ1处理后，其PD-L1的表达趋势与未经处理的4T1细胞一致。

第二步，构建PD-L1特异性靶向CRISPR/dCas9-KRAB质粒。

(1)设计、构建靶向PD-L1的CRISPR/dCas9-KRAB质粒：以pLvhU6-sgRNA hUbc-dCas9-KRAB-T2a-GFP质粒为载体，用BsmbI限制性内切酶将质粒所需酶切位点进行剪切，得到线性化的CRISPR/dCas9-KRAB质粒载体，同时设计合成多条sgRNA靶向PD-L1的上游启动子和5’UTR区域，将sgRNA分别克隆到线性化质粒载体中，然后进行连接形成环状质粒。经测序验证评价质粒的构建。

(2)通过市售脂质转染试剂将构建好的CRISPR/dCas9-KRAB质粒转染4T1细胞，72小时后用2.5g/L胰蛋白酶溶液消化，500r/min离心收集细胞，用PBS洗涤2次后制成PBS单细胞悬液，加流式抗体PD-L1-PE染色液室温作用30分钟，用流式细胞仪测定PD-L1的表达，实验按相同操作重复3次；72小时后提取细胞的RNA，用定量PCR反应观察PD-L1目的基因表达水平的变化，实验按相同操作重复3次；收集细胞裂解蛋白并测定蛋白浓度，配制10％SDS-PAGE电泳凝胶，每孔加入一定量的蛋白样品，跑胶后使用PVDF膜进行转膜。PVDF膜用5％脱脂牛奶封闭2小时后给予PD-L1抗体4度孵育过夜。用PBST漂洗干净后再用HRP-偶联的二抗37度孵育1-2小时，漂洗干净后进行显影成像观察PD-L1蛋白表达的变化。如图3、图4和图5所示，通过流式细胞，RT-qPCR以及Western Blot检测，构建的5条sgRNA中，含sg3序列的CRISPR/dCas9-KRAB质粒对4T1细胞PD-L1的靶向调控效率最高，约为45％。其碱基序列为：

正义链5’caccGTTATCTCATAGTATTTCCTG3’

反义链5’aaacCAGGAAATACTATGAGATAAC3’

第三步，合成环糊精改性聚(β-氨基酯)(CD-PBAE)

PBAE由经典的迈克尔加成反应聚合而成。以摩尔计，称取10份1，4-丁二醇二丙烯酸、6-9份5-氨基-1-戊醇(AP)、1-4份6-氨基环糊精，用一定体积无水DMF溶解，在70℃下反应36-96小时，冷却至室温，加入0.05-0.2份1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪，反应24-96h后将反应液滴入5-10倍体积无水乙醚，3000r离心10min，取沉淀真空干燥即得，通过核磁共振氢谱确定产物结构(图6)。

第四步，合成前药AD-SS-JQ1

用双硫键SS将JQ1与金刚烷乙酸(AD)连接形成前药AD-SS-JQ1：以摩尔计，1份JQ1与1.5份EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和1.5份N-羟基丁二酰亚胺(NHS)在无水DMSO反应6-12h后加入3份胱胺，继续反应36-96h，纯化后得中间产物；1份金刚烷乙酸与1.5份EDC和1.5份NHS在无水DMSO反应6-12h后，加入1份中间产物，继续反应36-96h，层析柱分离得到终产物AD-SS-JQ1，通过核磁共振氢谱确定产物结构(图7)。

第五步，复合纳米粒JQ1@CPP的制备及表征

以摩尔计，将10份CD-PBAE与1份AD-SS-JQ1共同溶解于DMSO，孵育过夜，通过AD与环糊精的相互作用，形成阳离子聚合物包合物JQ1@CD-PBAE(JQ1终浓度为200nM)，将JQ1@CD-PBAE与含PD-L1特异性靶向sgRNA的CRISPR/dCas9-KRAB质粒按80:1的质量比(仅计CD-PBAE的质量)在pH5.2的缓冲液中室温孵育30分钟，形成复合纳米粒JQ1@CD-PBAE-PD-L1(JQ1@CPP)。复合纳米粒中，CD-PBAE、AD-SS-JQ1和质粒三者的配比关系：质量比为80:0.1:1。

利用动态光散射(DLS)、zeta电位仪、透射电子显微镜(TEM)等对复合纳米粒的粒径、zeta电位和形貌进行研究。如图8所示：形成的复合纳米粒粒径约为250nm，电位呈正电，约为35.8mV，透射电子显微镜下可见类圆形的复合纳米粒。

第六步，体外评价复合纳米粒JQ1@CPP的靶向调控效率

将筛选后的CRISPR/dCas9-KRAB质粒按优化后处方制备复合纳米粒JQ1@CPP，考察PBS、CD-PBAE-PD-L1(CPP)、JQ1@CD-PBAE-GFP(JQ1@CPG)、JQ1@CPP对4T1细胞中PD-L1目的基因的靶向调控效率。

(1)从基因水平分析复合纳米粒对PD-L1的靶向调控效率。

①将4T1细胞用胰蛋白酶消化后配制成浓度为1x10

②分别配制PBS、CD-PBAE-PD-L1(CPP)、JQ1@CD-PBAE-GFP(JQ1@CPG)作为考察JQ1@CPP对4T1细胞中PD-L1目的基因的靶向调控效率的对照实验组。CD-PBAE-PD-L1(CPP)的配制方法为：将pH5.2的柠檬酸钠缓冲液溶解CD-PBAE，溶解的材料溶液用0.22μm水系滤头过滤除菌后备用，以质量比80:1与靶向PD-L1的CRISPR/dCas9-KRAB质粒复合，室温静置30分钟得到CD-PBAE-PD-L1(CPP)。JQ1@CD-PBAE-GFP(JQ1@CPG)的配制方法为：将pH5.2的柠檬酸钠缓冲液溶解JQ1@CD-PBAE，溶解的材料溶液用0.22μm水系滤头过滤除菌后备用，以质量比80:1与pMax-GFP质粒复合，室温静置30分钟得到CD-PBAE-PD-L1(CPP)。

③待贴壁细胞的密度达到70-80％时即可给药，吸去每孔原有的完全培养基，每孔用1mL无菌PBS洗两遍，再加入2mL无血清培养基，加入上述复合好的纳米粒溶液，轻轻摇晃培养皿混匀置于培养箱进行培养，培养4小时后用滴管吸去无血清培养基，直接每孔加2mL完全培养基继续培养36小时。

④转染72小时后收取细胞并提取RNA，在CRISPR/dCas9-KRAB特异性靶点附近设计相应的引物，用定量PCR反应观察PD-L1目的基因表达水平的变化。实验按相同操作重复3次。

如图9所示，JQ1@CPP对4T1细胞中PD-L1目的基因的靶向调控效率较对照组可达到65％，而经CPP处理后PD-L1下调40％，经JQ1@CPG处理后PD-L1下调40％。

(2)流式细胞术测定4T1细胞PD-L1表达变化。将构建好的复合纳米粒处理4T1细胞48小时后，2.5g/L胰蛋白酶溶液消化，500r/min离心收集细胞，用PBS洗涤2次后制成PBS单细胞悬液，加流式抗体PD-L1-PE染色液作用30分钟，用流式细胞仪测定PD-L1的表达。实验按相同操作重复3次。如图10所示，用流式细胞术检测经不同处理后4T1细胞PD-L1的表达水平与RT-qPCR检测结果趋势一致，经JQ1@CPP处理后PD-L1下调65％。

第七步，复合纳米粒JQ1@CPP的体内抗肿瘤效果及免疫机制分析。

选取Balb/c小鼠进行4T1细胞乳腺原位癌植瘤实验，待肿瘤长出后(50mm

肿瘤组织进行下述检测：

(1)取部分肿瘤组织提起细胞RNA，利用实时定量PCR观察PD-L1目的基因在转录水平的变化。实验按相同操作重复3次。如图13所示，JQ1@CPP组肿瘤组织中PD-L1的表达水平较PBS组下调65％，而CPP组与JQ1@CPG组较PBS组分别下调50％和45％。

(2)取部分肿瘤组织，制作成切片进行PD-L1免疫组化染色和TUNEL荧光染色分析，确定该复合纳米粒在小鼠肿瘤的治疗效果。如图14所示，肿瘤组织PD-L1免疫组化染色结果显示，JQ1@CPP组的肿瘤组织PD-L1阳性细胞数量相对PBS组明显减少，而CPP组和JQ1@CPG组中PD-L1阳性细胞均有不同程度的减少。如图15所示，TUNEL荧光染色结果显示，JQ1@CPP组的肿瘤组织凋亡细胞数量较PBS组明显增多，而CPP组和JQ1@CPG组中凋亡细胞均有不同程度的增加。

第八步，安全性综合评价复合纳米粒JQ1@CPP。

观察动物给药前后的活动情况和行为变化，收集主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)进行组织形态分析，评价其对体内有无毒性。如图16所示，经不同治疗组处理后，小鼠主要脏器HE切片染色分析均无明显病理改变，由此推论，此治疗方法安全有效。