一种调控SLE患者B淋巴细胞活化或增殖的生物标志物及应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种调控SLE患者B淋巴细胞活化或增殖的生物标志物及应用。本发明提供了一种调控SLE患者B淋巴细胞活化或增殖的生物标志物，所述生物标志物为LncRNA ENST00000537616。活化的Ba外泌体被B细胞摄取后，可通过释放其内容物LncRNA ENST00000537616至B细胞中，进而促进B细胞的活化和增殖。本发明首次发现了活化Ba外泌体中LncRNA ENST00000537616在SLE中促进B细胞活化的作用，为SLE发病机制的研究和临床诊治提供了新的方向。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种调控SLE患者B淋巴细胞活化或增殖的生物标志物及应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种可通过自身反应性B细胞过度活化产生大量致病性自身抗体和细胞因子等，进而诱发多个器官、系统受损的慢性自身免疫性疾病。以靶向B细胞活化等为中心的生物疗法，包括干预B细胞表面共刺激分子和活化因子，干扰B细胞内信号转导功能，甚至清除B细胞等是目前正在进行的临床试验的研究重点。

嗜碱性粒细胞(Basophils,Ba)是一种经典的固有免疫细胞，虽然其在人外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)中所占比例不超过1％，却在免疫性疾病中发挥着关键作用。Ba可以别自身反应性IgE激活，并归巢到次级淋巴器官中，促进Th2极化及自身抗体的产生，进而促进小鼠SLE及LN的进展。在MRL-lpr小鼠中，外周血Ba活化增加，清除Ba可以延长狼疮小鼠的身存时间，减少自身抗体IgG和IgE的产生。此外，Ba还与狼疮性肾炎活动度及疾病严重程度有关，抑制Ba活化可显著降低SLE患者的SLEDAI评分，改善SLE患者临床。另有研究发现，SLE患者的Ba可以归巢至淋巴结、脾脏等次级淋巴器官中。Ba可以促进B细胞增殖、类别转换、向浆细胞分化并产生以IgG为主的抗体。基于SLE患者和具有遗传背景的狼疮模型小鼠的研究发现，Ba异常活化后，主要通过归巢至次级淋巴器官(SLOs)中与B细胞相互作用参与SLE发病。然而，调控B细胞的分子机制仍有待明确，如何介导归巢Ba对B细胞活化的调控作用是临床研究和应用的重点方向之一。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种调控SLE患者B淋巴细胞活化或增殖的生物标志物及应用，为明确SLE的发病机制和临床上SLE的诊治提供了新的思路。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种调控SLE患者B淋巴细胞活化或增殖的生物标志物，所述生物标志物为LncRNA ENST00000537616。

本发明将活化的Ba来源的外泌体与B细胞共培养48h发现，Ba来源的外泌体可被B细胞摄取；进一步将活化的Ba与B细胞共培养发现，B细胞可以被活化，B细胞中LncRNAENST00000537616表达增加；而加入外泌体阻断剂GW4869后，活化的Ba对B细胞的促活化作用降低，B细胞中LncRNA ENST00000537616表达降低。因此，活化的Ba外泌体被B细胞摄取后，可通过释放其内容物LncRNA ENST00000537616至B细胞中，进而促进B细胞的活化和增殖。本发明首次发现了活化Ba外泌体中LncRNA ENST00000537616在SLE中促进B细胞活化的作用，为SLE发病机制的研究和临床诊治提供了新的方向。

作为本发明所述的生物标志物的优选实施方式，所述LncRNA ENST00000537616的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

作为本发明所述的生物标志物的优选实施方式，所述生物标志物存在于嗜碱性粒细胞外泌体中。

第二方面，本发明将LncRNA表达抑制剂在制备调控SLE患者B淋巴细胞活化或增殖的药物中应用，所述LncRNA为LncRNA ENST00000537616。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述表达抑制剂包括慢病毒载体。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述慢病毒敲低所述LncRNA的表达。

第三方面，本发明将嗜碱性粒细胞外泌体阻断剂在制备调控SLE患者B淋巴细胞活化或增殖的药物中应用。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述嗜碱性粒细胞外泌体阻断剂包括鞘磷脂酶抑制剂。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物为药学上可接受的辅料制成临床可用的药物剂型。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的活化的Ba源外泌体LncRNA ENST00000537616分子可促进B细胞活化与增殖，进而参与SLE发病。本发明将活化的Ba来源的外泌体与B细胞共培养48h发现，Ba来源的外泌体可被B细胞摄取；进一步将活化的Ba与B细胞共培养发现，B细胞可以被活化，B细胞中LncRNAENST00000537616表达增加；而加入外泌体阻断剂GW4869后，活化的Ba对B细胞的促活化作用降低，B细胞中LncRNA ENST00000537616表达降低。因此，活化的Ba外泌体被B细胞摄取后，可通过释放其内容物LncRNA ENST00000537616至B细胞中，进而促进B细胞的增殖。本发明首次发现了活化Ba外泌体中LncRNA ENST00000537616在SLE中促进B细胞活化的作用，为SLE发病机制的研究和临床诊治提供了新的方向。

附图说明

图1为光学显微镜下Ba状态；图中标尺为100μm；

图2为FCM验证负选后Ba纯度；

图3为Ba活化模型；

图4为光学显微镜下B细胞状态；图中标尺为100μm；

图5为FCM验证B细胞纯度；

图6为B细胞活化模型；

图7为LncRNA差异表达火山图(横坐标为fold change，纵坐标为P-value)；

图8为LncRNA差异表达聚类图；图中红色为表达上调，蓝色为表达下调，表达值越大，颜色越深；

图9为RT-qPCR验证噬碱性粒细胞源外泌体中LncRNA分子表达量；

图10为RT-qPCR验证SLE患者B细胞中LncRNA分子表达量；

图11为免疫荧光检测活化Ba源外泌体与B细胞共定位；图中标尺为100μm；

图12为RT-qPCR验证活化Ba与B细胞共培养后B细胞的活化指标；

图13为RT-qPCR验证活化Ba与B细胞共培养后B细胞中LncRNA ENST00000537616的表达量；

图14为LncRNA ENST00000537616的相关信息；

图15为荧光显微镜下慢病毒对B细胞的转染效果；图中标尺为100μm；

图16为RT-qPCR验证LncRNA ENST00000537616在B细胞中的转染效率；

图17为CCK-8验证LncRNA ENST00000537616对B细胞活力的影响；

图18为FCM验证LncRNA ENST00000537616对B细胞U266的增殖影响；

图19为FCM验证LncRNA ENST00000537616对B细胞Raji的增殖影响；

以上图中，

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。人类基因组中存在大量不编码蛋白质的RNA，被称为非编码RNA，其中转录本＞200个核苷酸的非编码RNA称为长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)。外泌体是由细胞内的多囊泡体(Multivesicular bodies,MVB)分泌的一种膜性囊泡(30-200nm)，由不同组织和器官的细胞释放到细胞外环境中,可从细胞培养上清液及各种体液中分离出来。外泌体在细胞通讯中起着重要作用，可以与靶细胞融合或通过内吞作用被靶细胞吸收。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：构建Ba体外活化模型

1、临床标本

临床血液标本来自于2021年6月至2022年2月在广东医科大学附属医院明确诊断为SLE患者。招募健康志愿者抽取外周血，用于分离人外周血Ba及B细胞构建SLE体外活化模型。本发明通过广东医科大学附属医院伦理委员会审核及批准。所有入组的SLE患者诊断均符合1997年修订的美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)分类标准；排除合并有感染、乙肝、过敏性疾病、类风湿性关节炎等其他自身免疫性疾病、肿瘤和其他严重全身性疾病的患者。

2、Ba的提取

将EDTA抗凝管中的人外周血置于15mL离心管中，加入1mL HetaSep

3、Ba的培养

完全培养基配制：5％无外泌体FBS，1％双抗，5ng/mL IL-3，X-Vivo

4、Ba的活化

用2μg/mL anti-Human IgE(ε-chain specific)活化Ba，在含5％ CO

5、Ba外泌体的分离

将Ba培养上清离心，300g，10min，4℃，去除细胞，取上清；离心，2000g，10min，4℃，去除死细胞，取上清；离心，10000g，30min，4℃，去除细胞碎片，取上清；将上清用0.22μm的滤网过滤。离心，120000g，90min，4℃，去除上清，剩余沉淀为外泌体及杂蛋白；用提前预冷的商品化PBS重悬。离心，120000g，90min，4℃，去除上清，得到外泌体。用提前预冷的商品化PBS重悬，将外泌体分装置于-80℃冰箱备用。

6、Ba外泌体的鉴定

(1)电镜鉴定

用PBS将5μL外泌体按1:1比例进行稀释，轻轻吹打混匀；吸取10μL的外泌体悬液并滴加于铜网上，沉淀静置2min后用滤纸吸去浮液；吸取10μL 2％的醋酸双氧铀并滴加于铜网上，静置1min后用滤纸吸去多余的醋酸双氧铀染液，常温干燥3min；JEM-1400型透射电子显微镜，观察外泌体的形态，工作电压80kV，Gatan832 CCD相机记录。

(2)NTA鉴定

取外泌体10μL，加入990μL PBS轻轻吹打混匀；用1mL注射器将样品注入NanosightNS300纳米颗粒跟踪分析仪的样品槽中，让样品匀速通过纳米检测孔，观察并记录相关结果。

由于SLE患者体内Ba处于活化状态，构建了Ba体外活化模型(模拟SLE患者体内活化的Ba)。通过EasySep

实施例2：构建B细胞体外活化模型

1、SLE患者B细胞的提取

提取配备含2％ FBS的PBS；将EDTA抗凝管中的人外周血置于50mL离心管中，按外周血：含2％ FBS的PBS＝1:1的比例添加含2％ FBS的PBS，充分混匀；将淋巴分离液置于50mL淋巴管中，按淋巴分离液：外周血：含2％ FES的PBS＝1:1:1的比例，用1mL枪头缓慢添加步骤(2)中的混合液于淋巴分离液上方；离心，800g，20min，室温；离心后，去除上层血浆，取云雾层外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)于新的50mL离心管中，加4倍体系的含2％ FBS的PBS洗涤；离心，3000rpm，10min，室温，去除血小板；去除上清，继续用含2％ FBS的PBS重悬洗涤；离心，1200rpm，10min，室温；去除上清，用1mL-1.5mL含2％ FBS的PBS重悬PBMC，置于5mL流式管中；计数，将细胞浓度调整为5×10

2、B细胞的培养

完全培养基配制：10％ FBS，1％双抗，1μg/mL IL-2，0.0035％β-巯基乙醇，X-Vivo

3、B细胞的活化

用anti-IgM(BCR活化通路，SLE患者B细胞活化1级信号)，sCD40L(活化B细胞活化共刺激因子CD40通路，SLE患者B细胞活化2级信号)，IL-4，IL-21(SLE患者B细胞活化3级信号)活化B细胞，构建B细胞体外活化模型。

经EasySep

实施例3：转录组测序

1、提取B细胞RNA

Trizol法提取RNA，具体如下：

将细胞接种于6孔板种，5％ CO

2、提取外泌体RNA

上清用0.22μm的无菌滤网过滤以排除大于0.8μm的颗粒。加1体系buffer XBP至1体系的样本中(1：1)。上下颠倒5次混匀；加样本/XBP混合物到exoEasy spin柱子中(最多16mL)，离心500g，1min，丢弃液体并将柱子放到相同的收集管中。重复这一步骤直到所有的样本都经柱子滤过。加10mL XWP并离心5000g，5min洗柱子，移除残留的buffer，将废液与收集管一起丢掉。离心过后，小心移除柱子，避免接触到液面。将柱子转移到新的收集管中。加700μL QIAzol到膜上。离心，5000g，5min，收集裂解物。将裂解物转移到2mL的管中。简单涡旋振荡并在室温孵育5min。这一步促进了核蛋白质的解离。如果使用参照对照，此时应将它们添加到裂解液中。加90μL氯仿到裂解物中。盖紧盖子剧烈甩15s。彻底混匀对后续相分离很重要。室温孵育2-3min。离心，12000g，15min，4℃。离心后，在离心机中复温到室温。离心后，样本会分为三层：上层为含有无色水相的RNA；中层为白色间层；下层为红色有机相。水相层的体系约400μL。将上层水相层转移到新的收集管中。避免吸到中间层。加2体系无水乙醇(400μL水相层加800μL无水乙醇)并上下颠倒数次混匀。吸取最大700μL样本，包括已经形成的任何沉淀，转移到2mL收集管中的RNeasy MinElute柱子中。轻轻盖上盖子，离心，≥8000g(≥10000rpm)，15s，室温。丢弃废液。用同样方法将剩余的样本继续转移到该收集管中。加700μL Buffer RWT至RNeasy MinElute柱子中。轻轻盖上盖子并离心≥8000g(≥10000rpm)15s。丢弃废液。下一步继续使用该收集管。吸取500μL Buffer RPE到RNeasyMinElute柱子中。轻轻盖上盖子并离心，≥8000g(≥10000rpm)，15s。丢弃废液。下一步继续使用该收集管。吸取500μL Buffer RPE到RNeasy MinElute柱子中。盖上盖子并离心，≥8000g(≥10000rpm)，2min。丢弃收集管及其中的废液。离心后，从收集管中小心移去RNeasyMinElute柱子，避免柱子接触到液面。将RNeasy MinElute柱子放入新的2mL收集管中。打开盖子，全速离心5min使膜变干。丢弃废液及收集管。为了避免损坏旋转柱盖子，将柱子放入离心机离心时两个柱子之间至少要隔一个空位，盖子的方向与离心旋转的方向相反。将该柱子放到一个新的1.5mL收集管中。直接加14μL RNase-free水至旋转柱的中心。轻轻地盖上盖子，让柱子静置1min，然后全速离心1min洗脱RNA。

3、RNA逆转录

(1)mRNA逆转录

试剂盒：TAKARA Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)，mRNA逆转录体系如表1和2所示。

表1去除基因组DNA反应体系

反应条件：42℃，2min，4℃；10μL体系中，RNA量不应大于1μg。

表2mRNA逆转录的反应体系

反应条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃。

(2)miRNA逆转录

试剂盒：Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit

miRNA逆转录反应体系如表3所示。

表3miRNAs逆转录反应体系的配制

反应条件：第一阶段，逆转录反应，37℃，1h；第二阶段，逆转录酶的失活反应，85℃，5min。

4、qPCR

试剂盒：TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)

TB green染料法qPCR反应体系如表4所示。

表4qPCR反应体系

反应条件：第一阶段，预变性(1cycle)，94℃，30s；第二阶段，qPCR反应(40cycle)，95℃，5s变性；60℃，20s退火、延伸。

5、引物序列

ENST00000537616的引物序列为：

F:CAGAGCAGGTAGCCAACCACTTC；

R:GGTCCAGTTAGTCACTCAGAATCCATC。

对正常人外周血来源的未活化的Ba和经Anti-IgE诱导活化的人Ba源外泌体进行了全转录组学测序，通过差异表达分析发现，与未活化Ba源外泌体相比，活化的人Ba外泌体中LncRNA具有显著表达差异。火山图(见图7)和差异表达聚类图(见图8)结果中提示，与未活化Ba相比，活化Ba外泌体中ENST00000537616、NR_024480、ENST00000513626、ENST00000488188和uc001yrs.3等LncRNA表达显著升高，uc031tgb.1、ENST00000355500、AY726569、和TCONS_12_00007006等LncRNA表达显著降低。

筛选了活化的Ba源外泌体中与B细胞功能相关的LncRNA分子进行RT-qPCR验证。结果发现LncRNA ENST00000537616在活化的Ba源外泌体中显著高表达(见图9)。为了验证在SLE患者B细胞中LncRNA ENST00000537616的表达量，检测了健康人与SLE患者B细胞中LncRNAENST00000537616的表达情况，结果发现，与健康人相比，SLE患者B细胞中该分子的表达量显著增加(见图10)；因此，推测LncRNA ENST00000537616可能是调控B细胞发挥作用的关键分子。

通过RT-qPCR检测了活化后的B细胞中LncRNA ENST00000537616分子的表达情况，发现与未活化的B细胞相比，活化后的B细胞中的LncRNA ENST00000537616表达水平并未升高，推测可能是因为缺乏Ba微环境的刺激。

实施例4：Ba与B细胞共培养

Transwell的下室接种Ba，上室接种B细胞，含5％ CO

免疫荧光检测B细胞对Ba外泌体的摄取情况，具体如下：

将活化的Ba与B细胞共培养48h,收集B细胞，重悬为300μL。将2μL PKH26染液用300μL Dilute C稀释液稀释后与B细胞悬液混合，吹打混匀，室温避光孵育5min，加入等体积(600μL)的1％ BSA终止染色，室温静置1min；用X-VIVO

检测了活化的Ba源外泌体对B细胞的影响，将活化的Ba与B细胞共培养，通过免疫荧光发现，B细胞可以摄取活化的Ba源外泌体；进一步在Ba活化的同时加外泌体阻断剂GW4869培养15min后，将活化的Ba与B细胞共培养，发现外泌体数量明显降低(见图11)。为了验证活化Ba外泌体对B细胞中LncRNA的影响，将活化后的Ba与B细胞共培养，48小时后检测B细胞的活化指标及LncRNA的表达情况，结果显示，活化的Ba可促进B细胞活化，且促进了B细胞中LncRNA ENST00000537616的表达；而加了外泌体阻断剂GW4869后，Ba对B细胞的促活化作用下降(见图12)，且B细胞中LncRNA ENST00000537616的表达下降(见图13)，表明活化的B细胞LncRNA ENST00000537616的增加可能来源于活化Ba源外泌体的刺激；以上结果共同表明，活化的Ba源外泌体可被B细胞摄取并释放其内容物LncRNA ENST00000537616促进B细胞活化。LncRNA ENST00000537616是一种位于12号染色体的长度为2508bps的长链非编码RNA(见图14)，RNA碱基序列如SEQ ID No.1所示。通过LncRNA相关数据库进行生物信息学预测发现，其与B细胞的功能密切相关。

LncRNA ENST00000537616的RNA碱基序列如下所示：

ggtttggcttgaaatgtcatatttcagaatgtgcatagaggccaggggtggtggatcacacctgtgatccacctgcctcggcctcccaaagtgttgagattacaggcatgagccactgcacctggcctgctcagtgacttctaacattgctgctgtacctgggtaaatacttccagtcatatttaagcgggcttggagttggcaaaatctctgagagagacatcttcggaaagcctccatgctggacttagtggataaagtttccaatgtccagatattttcagctggtttctccttggtataggatttcttctgcattctaccctgcacatcttaatgataaccctcatattttggctaagcatttgactcccctttagaattgttctaacttgtttttaacagatgtctacaagagattcccaccaggatcctgcccatgcaatctttgagactttaaactcactccagctggaaataggaaccaacttaacccaagagactttggttcacatttaaccagtactttcctgaatgcctctcctaagtaaatggctctagtttctctattggccactgcactgccactaggattcctgcaagggatccgatgggcccagagcaggtagccaaccacttctctgttggatggaatgcaatgctgtttgccagcatgtttgagccagtccttcaagatggattctgagtgactaactggacctaaatttaaatagcacaaagcagccatttgctaactagatttcatacaaatgctctgagttcctggaaaacccacactccttaactttgggactttcaagactcacctaaatcaatcaattaaagctcacttgtgtcagctaatcagggatcagctgtattgactaatgaaaactaagcgagtttcaaattttaaccatttatttgtgtagaagacttgattgggagcctgggtatgaatacttgctataaaatctgagcattccctttgttctctggagcaaacaatgttaagttgttaactctctgtacctttctctagaactggatggaaacaactccatctgaaatgcagccctaataccagggaactcctacagtaaagcgctaaacaactttattactctaaccaacgtttatgtccctaatcagcaagaagtagttagaatggtcatcatccctttccctcaagattgaggaatggacataaaaaggaggggatttgtaactgctccagactgatctgttgtcagaaaggggctcttgaaccagaccatgaaagagggttcttggatctcctgcaggaaggaattcaaggagagtcacagagtgtagagagaatagacagtttattgaaagctactcagttacagagtagggcatcctccaaaagcaggaggaggaatgtgctgtctttgttttaaactcttcttttataggggtttaatctatgtaaaacctaagctatgtctacatgtgggtaggctgtcagtgtgacaaaatttagtattttgttgatataaagaaacttatccttgtcatcttagtgcataagtacatcaaagtatgactttagctaccttaaaagcatgtattgttatgtgatattgggacatctggacattctgctgtcgtaggagtttgtccttgcagcattactaaatcgcttccttagctgtaaacatcttataatcgtaggtcataactgtcaaggaagtgccttgctagtttttagatggagttgattttaaaatagtgtcactctggctttcctatgctcctgctttcctaacaaatctggttcaactttttttttttttattcaacataatcttttttttccatgctacctcatttacagagtgcttcctatagatatggttggtctgtatgtttcatttttcagctttgattcttatttttttgaatcacacatgctttatgggggcttccactaccatgagccatattttctgtattaccagcaagatgtttgggtttgttttttgttttctttatatttcaaattttattttagatttaggaagtacgtgtgcaggtttgttaacatgggtgtattgcatgacgctgatcttacaataccaatgatcccatcactcaggtagtgagcataatatccaataggtagtttttcagaacttgccttatcttccctctctccctgctctcttaattcgaagcctatttttcctatctttatgtccacatgtttccagcatttagctcccacttatacgtgagagtatgtggtatttgtttttctgtgtctgcattaatttacttaggatgatggcttccagctgcatcttttgttgcaaaggacatgactttgttcttttttatgactgtgtagtattccatggtgtatatgtaccacattttctttatccagaacactgttgataggcatctacattgattccatgtcttggctattgtgaatagtgcagcaataaacatgcatggttcaacttttatggtaacaaa。

实施例5：检测B细胞的活化、增殖

(1)B细胞系(Raji，U266)的复苏

提前配备完全培养基:10％ FBS，1％双抗，RPMI 1640培养基。从液氮中取出B细胞株(Raji，U266)，在37℃水浴箱中迅速晃动，冻存管内容物由固态完全变成液态时取出，用纱块擦干，酒精消毒后放入超净台。迅速将冻存管中的细胞转移到15mL离心管中，用完全培养基重悬至5mL，离心(300g，6min,室温)。去除上清，用2mL PBS重悬，洗涤，离心(300g，6min，室温)。去除上清，用完全培养基重悬，将细胞转移到T25培养瓶中，5％ CO

(2)B细胞系的培养

配备完全培养基：10％ FBS，1％双抗，RPMI 1640培养基。含5％ CO

(3)B细胞系的换液

细胞培养48h后，完全培养基中的营养物质基本被消耗完毕，可观察到完全培养基颜色发生改变，需要对细胞进行换液。将细胞收集于15mL离心管中，离心，300g，6min，室温。去除上清，用2mL PBS洗涤，离心，300g，6min，室温。去除上清，加入新鲜的完全培养基，将细胞悬液移入新的培养瓶或培养板中，5％ CO

(4)B细胞系的传代

细胞长至80％～90％时可进行传代(正常增殖细胞48h可传代)。将细胞收集于15mL离心管中，离心，300g，6min，室温。去除上清，用2mL PBS洗涤，离心，300g，6min，室温。去除上清，加入新鲜的完全培养基，将细胞悬液按1传3的比例移入新的培养瓶或培养板中，5％ CO

(5)B细胞系的转染

将细胞系(U266、Raji)悬液按4×10

(6)流式细胞术检测B细胞的活化

细胞培养48h后，收集于5mL流式管中，离心，300g，6min，室温。去除上清，用PBS洗涤，离心，300g，6min，室温。去除上清，用100μL PBS重悬，每管细胞加入2.5μL APC-CD86抗体，4℃孵育30分钟，加入1mL PBS洗涤，离心，300g，6min，室温，重复洗涤一次，去上清，用300μL PBS重悬，上机。

(7)流式细胞术检测B细胞的增殖

细胞培养72h后，收集于5mL流式管中，离心,300g，6min，室温。去除上清，用PBS洗涤，离心，300g，6min，室温。去除上清，用100uL PBS重悬，每管加入2.5uL FITC-CD19抗体，4℃孵育30min，加入1mL PBS洗涤，离心，300g，6min，室温，重复洗涤一次，去上清每管加入1mL提前预冷的70％无水乙醇固定、破膜，4℃放置24h，离心，300g，6min，室温。重复洗涤一次。去除上清，用100μL PBS重悬，每管细胞加入2.5μL Alexa fluor 647-ki-67抗体，4℃孵育30min,加入1mL PBS洗涤，离心，300g，6min，室温，重复洗涤一次，去除上清，用300μL PBS重悬，上机。

在B细胞系(Raji和U266)中用带有eGFP荧光标记的慢病毒转染过表达LncRNAENST0000537616，通过荧光显微镜观察发现，慢病毒可有效转染B细胞(见图15)；通过RT-qPCR验证慢病毒的转染效率，结果显示，LncRNA ENST0000537616可成功在B细胞中过表达(见图16)；为了验证LncRNA ENST00000537616对B细胞的作用，检测了其对B细胞增殖的影响，通过CCK8实验检测其对B细胞活力的影响，结果表明，LncRNA ENST00000537616可明显增强U266-B和Raji-B细胞的活力(见图17)；进一步通过FCM检测Ki-67的结果显示，LncRNAENST00000537616可明显促进U266-B细胞增殖(见图18)；也可以促进Raji-B细胞的增殖(见图19)。以上结果共同表明，LncRNA ENST00000537616可促进B细胞的增殖。

本发明将活化的Ba来源的外泌体与B细胞共培养48h发现，Ba来源的外泌体可被B细胞摄取；进一步将活化的Ba与B细胞共培养发现，B细胞可以被活化，B细胞中LncRNAENST00000537616表达增加；而加入外泌体阻断剂GW4869后，活化的Ba对B细胞的促活化作用降低，B细胞中LncRNA ENST00000537616表达降低。因此，可推断，活化的Ba外泌体被B细胞摄取后，可通过释放其内容物LncRNA ENST00000537616至B细胞中，进而促进B细胞的增殖。本发明首次发现了活化Ba外泌体中LncRNA在SLE中促进B细胞活化的作用，为SLE发病机制的研究提供了新思路。

此外，在U266 B细胞系中过表达LncRNAENST0000537616，可促进BCR通路中PPP3CB、FOS、NRAS、RAF1、RASGRP3、JUN、MAPK1及BCL10等分子的表达，抑制AKT3、NFAT5和PRKCB等分子的表达；在Raji B细胞系中过表达LncRNAENST0000537616，可促进BCR通路中PPP3CB、KRAS、NRAS、BCL10和MAPK1的表达。在Raji B细胞和U266 B细胞中敲低LncRNAENST00000537616的表达，均可显著抑制KRAS的表达。因此，KRAS是Ba源外泌体LncRNAENST00000537616调控B细胞增殖的靶点之一。在Raji B细胞和U266 B细胞中过表达LncRNAENST00000537616可显著促进PPP3CB的表达；在U266-B细胞中敲低LncRNAENST00000537616可显著抑制PPP3CB的表达。因此，PPP3CB是Ba源外泌体LncRNAENST00000537616调控B细胞增殖的重要靶点之一。推测LncRNA ENST00000537616是否可通过竞争性结合特定的microRNA调节KRAS或PPP3CB的表达进而促进B细胞增殖。通过生物信息学预测发现LncRNAENST00000537616可能通过LncRNA ENST00000537616/has-miR-330-5p/KRAS轴或LncRNA ENST00000537616/has-miR-326/KRAS轴调控B细胞的活化。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。