木质素合成和MAPK信号通路在增强苦瓜抗枯萎病的应用

摘要

本发明公开了木质素合成和MAPK信号通路在增强苦瓜抗枯萎病的应用，通过控制苦瓜中PAL,CYP73A,CCoMT,CAD和POD基因中的一种或多种持续高表达促进苦瓜中木质素的合成，从而增强苦瓜抗枯萎病的能力；通过钙离子激活MAPK信号通路，诱导防御相关基因的表达。本发明还提供一种增强苦瓜抗枯萎病能力的方法，通过施加促进木质素合成的肥料或促进剂来增强苦瓜抗枯萎病能力。

说明书

技术领域

本发明属于蔬菜抗病研究技术领域，具体涉及木质素合成和MAPK信号通路在增强苦瓜抗枯萎病的应用。

背景技术

苦瓜(Momordica charantia L.)是一种天然保健蔬菜，药理研究表明，苦瓜具有降血糖、抗氧化等保健作用，随着人们对苦瓜营养价值和诸多食疗功效认识的提高，苦瓜产业发展迅速，栽培面积逐年扩大。但在苦瓜生产中,由于多年连作导致土壤环境恶化,连作障碍日益严重,土传病害随之加重。苦瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusariumoxysporum f.sp.momordicae)引起的一种典型的土传病害,在中国各苦瓜种植区均有发生,可造成苦瓜萎蔫干枯,最终全株死亡。据报道,苦瓜枯萎病一般发病率为15％～25％,严重时高达60％～80％,病害流行时田间出现大量死藤,给江西省苦瓜的生产带来严重经济损失。目前对苦瓜抗病基因的鉴定及抗病分子机制的研究尚不多见。

发明内容

为了解决上述问题，本发明采用尖孢镰刀菌苦瓜专化型致病菌接种BK0604(高抗)和LK0901(高感)，鉴定苦瓜对枯萎病的抗性相关基因。然后，通过RNA测序、抗氧化酶活性检测和超微结构分析，发现木质素生物合成和钙介导的MAPK信号通路可能调控木质素的形成，诱导与枯萎病抗性相关的致病相关(PR)基因的表达。为了更好地增强苦瓜抗枯萎病能力，本发明提供了木质素合成和MAPK信号通路在增强苦瓜抗枯萎病的应用。

本发明采用了下述技术方案：

本发明提供木质素合成和MAPK信号通路在增强苦瓜抗枯萎病的应用。

特别地是，通过控制苦瓜中PAL,CYP73A,CCoMT,CAD和POD基因中的一种或多种持续高表达促进苦瓜中木质素的合成，从而增强苦瓜抗枯萎病的能力。

特别地是，通过CaLM/CML通路介导NO来增强细胞壁抵抗能力，促进CaLM/CML同源基因表达水平来提高苦瓜抗病能力。

特别地是，通过钙离子调控CDPK及其下游Rboh基因的表达，催化组织中ROS(活性氧)的生成，通过抑制FLS2的表达来抑制ROS产量的快速增加。FLS2可与BAK1形成复合体，这可以将病原体相关的分子模式信号感知与转导联系起来。

特别地是，通过钙离子激活MAPK信号通路，诱导防御相关基因的表达。

本发明还提供一种增强苦瓜抗枯萎病能力的方法，通过施加促进木质素合成的肥料或促进剂来增强苦瓜抗枯萎病能力。

为鉴定苦瓜对枯萎病的抗病基因，本发明采用接种BK0604(高抗枯萎病)和LK0901(高感枯萎病)。通过然后通过RNA序列、抗氧化酶活性测定和超微结构观察，发现木质素生物合成和钙介导的MAPK信号通路可能通过调控木质素形成和诱导致病相关(PR)基因的表达参与了枯萎病的抗性。本发明还揭示了真菌感染、植物细胞壁分解代谢和调控途径之间的分子关系。该研究结果为进一步研究枯萎病相关基因和分子育种提供了有价值的信息。

附图说明

图1为高抗、高感苦瓜表型和抗病指数；

图2为不同样本见差异表达的基因；

图3为20个差异表达基因在抗、感苦瓜品种中的表达模式；

图4为枯萎病菌侵染后2个苦瓜品种O·2-产生速率的差异；

图5为枯萎病菌侵染后2个苦瓜品种POD酶活性的差异；

图6为枯萎病菌侵染后2个苦瓜品种CAT酶活性的差异；

图7为枯萎病菌侵染后2个苦瓜品种PAL酶活性的差异；

图8为枯萎病菌侵染后2个苦瓜品种SOD酶活性的差异；

图9为枯萎病菌侵染后抗、感苦瓜透射电镜图；

图10为枯萎病菌侵染后抗、感苦瓜叶片和根系表皮细胞的结构特征；

图11为木质素合成途径示意图；

图12为苯丙素生物合成途径基因表达谱；

图13为苯丙素合成途径中POD基因的表达谱；

图14为钙离子调节通路途径示意图；

图15为钙离子调控中相关差异基因热图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详细阐明。

实施例

通过对苦瓜根系枯萎病侵染多个时间点的测序，鉴定了其抗病相关调控基因。结果发现，多个比较组中均发现了DEGs，这些DEGs主要富集在苯丙素生物合成、苯丙氨酸代谢、植物与病原体互作，MAPK信号通路等途径。通过比较抗病品种和感病品种的差异，我们发现抗病品种合成木质素的相关基因表达水平显著改变，这些变化会导致更多木质素且进一步形成填充体阻止菌丝从木质部导管扩散。另外，抗病品种中MAPK信号通路相关基因表达水平可能特异性的更加激活，从而诱导更多或更早的抗病基因表达，从而增强抗病品种的抗病能力。枯萎病的侵染导致各种抗氧化酶活性显著增强，比如SOD，POD。而不同抗性品种之间超氧阴离子、PAL、CAT和MDA差异显著。总之，推测抗病苦瓜品种在受到致病菌侵染后为了防止菌丝的进一步入侵会形成更多的木质素，钙离子信号通路会激活活性氧和加固细胞壁，MAPK信号通路的激活诱导抗病基因表达。

1.试验材料与方法

1.1试验材料

供试材料为BK0604和LK0901，其中BK0604经多年多点人工接种鉴定、田间病圃鉴定及第三方检测为高抗枯萎病苦瓜品种，LK0901经多年多点人工接种鉴定、田间病圃鉴定及第三方检测为是高感枯萎病苦瓜品种。尖孢镰刀菌苦瓜转化型为本团队收集，经鉴定为强致病力菌株。两品种苦瓜种子先浸种17h，用纱布包裹置于32℃恒温培养箱中催芽，待种子露白后播于32孔穴盘中，每品种重复3次，每次30株。

试验处理：抗病品种为BK0604，未接种赋予代号RM，接种后6天赋予代号RI6、12天赋予代号RI12、接种15天赋予代号RI15。感病品种为LK0901，未接种赋予代号SM，接种后6天赋予代号SI6，12天赋予代号SI12，感病品种没有接种15天，原因是在15天的时候高感LK0901所有处理幼苗全部死亡。感性品种三个比较组为RM与RI6、RM与RI12、RM与RI15。感病品种两个比较组为：SM与SI6、SM与SI12。所以五个比较组为：RM与RI6、RM与RI12、RM与RI15、SM与SI6、SM与SI12。例：RM与RI6为抗病组BK0604中未接种与接种后6天的差异基因。

1.2真菌侵染试验

待苦瓜幼苗长至两叶一心时拔出,洗净根部基质,在枯萎病菌孢子悬浮液(1×10

1.3RNA提取、文库构建以及测序

文库制备及转录组测序分析使用总RNA提取试剂盒(Invitrogen，美国)提取样品的总RNA，质检合格后，真核生物转录组文库构建使用NEB#7530试剂盒(New EnglandBiolabs，美国)，文库质检(DNA 1000assay Kit，Agilent，美国)合格后，每个样品构建一个300bp～500bp片段长度的双端(Paired-end，PE)测序文库，在Illumina HiSeq2500测序仪(Illumina，美国)上进行PE150测序。每个处理三次重复。

1.4抗氧化酶活性的测定与分析

接种处理和未接种对照在相同时间点取样。取样时间为接种前(0d),接种后每隔48h取样,连续5次,设3次重复,采集相同叶位(第1和第2片真叶)。O

1.5扫描电镜观察

取样：将新鲜组织迅速投入电镜固定液室温固定2h，再转移至4°保存。固定：固定好的样品经0.1M磷酸缓冲液PB(PH7.4)漂洗3次，每次15min。0.1M磷酸缓冲液PB(PH7.4)配制1％锇酸室温避光固定1-2h。0.1M磷酸缓冲液PB(PH7.4)漂洗3次，每次15min。脱水：组织依次入30％-50％-70％-80％-90％-95％-100％-100％酒精每次15min,乙酸异戊酯15min。干燥：将样本放入临界点干燥仪内进行干燥。样本导电处理：将样本紧贴于导电碳膜双面胶上放入离子溅射仪样品台上进行喷30s左右。HITACHI SU8100扫描电子显微镜下观察采图。

1.6六胺银染色观察

石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗1遍，蒸馏水洗1遍。媒染剂染色：切片入六胺银(PASM)染液A浸泡过夜，水稍洗。组织酸化：切片入六胺银(PASM)染液B处理15min–20min，蒸馏水洗3-5次。、孵育染色：工作液提前置于60℃烤箱预热，滴加预热好的工作液于组织切片上，加盖孵育(56℃-59℃)。显色：孵育40min后将切片拿出在镜下观察。以后每隔10min取出切片在镜下观察，直至染色结果满意为止。六胺银(PASM)染液F处理：六胺银(PASM)染液F稍处理。脱水封片：切片依次放入无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片。最后显微镜镜检，图像采集分析。

1.7基因表达验证

qRT-PCR验证20个不同表达量的基因。总RNA提取参照赛默飞世尔科技(中国)有限公司Invitrogen

表1RT-qPCR所用引物

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2实验结果

2.1两种基因型苦瓜的不同表现

BK0604生长势强，分支力强，商品果纺锤形绿白色，长棒，有光泽。LK0901，植株分枝力强，长势强，耐热，果实棒形，刺状瘤，墨绿色。采用浸根接种法在苗期对两个苦瓜品种进行枯萎病接种。接种后15d，发现CK(无菌水接种)没有表现出黄化、萎蔫的现象。而对于苗期接种后的两个苦瓜品种，BK0604没有显症，LK0901植株出现子叶黄化，植株萎蔫的现象，其病情指数分别为3.13和100，证明BK0604为高抗枯萎病苦瓜品种，而LK0901是高感枯萎病苦瓜品种，也表明这两个苦瓜品种是非常适合用于鉴定抗病基因的供试材料。接种后三次取样时间赋予代号RI6(高抗BK0604接种后6天)，RI12(高抗BK0604接种后12天),RI15(高抗BK0604接种后15天),和SI6(高感接种后6天)，SI12(高感接种后12天)，以上这些取样时间作为RNA取样时间。本试验构建了三次生物学重复的21个RNA-seq文库。共得到了6.28G的原始数据。在过滤的低质量的读取后，大约还有6.24G的待分析数据。将待分析数据与苦瓜基因组进行比对，83.75％–89.26％的数据与参考基因组匹配，其中82.43％–87.63％在参考组上只要一个匹配点，1.31％–1.69％在参考组上有多个匹配点(表S2)。基于转录组数据，一共发现30,643个基因其中包括1212个新基因，FPKM法适用于双端测序文库，其公式能够抵消基因编码区碱基数样品测序片段数差异对基因表达量运算的影响，FPKM值可直接用于比较不同组间的基因表达差异。主成分分析结果显示，各样品具有较高的客观性，其结果可用后续分析。

表2数据统计

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2.2差异基因表达分析

为研究接种后高抗、高感苦瓜品种不同响应，首先，三次取样时间与空白对照组进行比较，结果表明RM与RI16相比较有3533个DEGs(1843个上调基因和1690个下调基因)，RM与RI12相比较有2265个DEGs(1550个上调基因和715个下调基因)，RM与RI15相比较有4136个DEGs(1963个上调基因和2173个下调基因)，SM与SI6相比较有3790个DEGs(1789个上调基因和2001个下调基因)，SM与RI12相比较有3713个DEGs(2013个上调基因和1700个下调基因)。另外，对BK0604和LK0901两苦瓜品种间差异基因进行了比较。结果显示，接种前，RM与SM相比较共找到1727个DEGs(908个上调基因和819个下调基因)。接种6天后，RI16、S16间差异基因略有减少，为1546个DEGs(789个上调基因和757个下调基因)，而SI12与RI12的DEGs数量在接种12天后增加到2974个(1561个上调基因和1416个下调基因)。

进一步分析表明，BK0604在三次取样时间点中共有1279个相同的DEGs，而接种第6、12、15天中，分别鉴定出1151、270和1524个特定时间的DEGs。对LK0901而言，在接种后第6、12天，分别发现1281和1204个特定时间点的DEGs，在二次取样时间点中共有2509个相同的DEGs。此外，BK0604和LK0901的五个比较组中(RM与RI6、RM与RI12、RM与RI15、SM与SI6、SM与SI12)，共发现了704个相同的DEGs。这些相同的DEGs可能与病原菌入侵后的反应有关系，但与苦瓜抗病没有关系。将接种后的抗、感苦瓜品种与三个取样时间点的基因表达谱进行比较，结果显示，接种后6、12天时分别发了366和1567个特定时间点的DEGs，其中在两个取样时间共有602个相同的DEGs。

2.3DEGs功能富集

BK0604而言，对三个比较组(RM与RI16、RM与RI12、RM与RI15)的共同基因进行KEGG注释，结果显示，这些DEGs在苯丙素合成途径、苯丙氨酸代谢、植物与病原互作、MAPK信号通路等通路中显著富集。LK0901而言，两个比较组(SM与SI6、SM与SI12)注释结果显示，除苯丙素合成途径、苯丙氨酸代谢、植物与病原互作、MAPK信号通路外，其显著富集的通路与抗病品种相似，如类黄酮合成途径、植物信号转导。同时，对五个群集(RM与RI6、RM与RI12、RM与RI15、SM与SI6、SM与SI12)的相同DEGs进行了注释，发现除黄酮类化合物生物合成和植物激素信号转导不显著富集外，其他显著富集途径与感病品种相似。对接种后BK0604、LK0901两个取样时间的不同DEGs进一步注释，结果显示，接种后DEGs的主要富集途径为苯丙氨酸合成、苯丙氨酸代谢途径和植物激素信号转导途径。

2.4基因时间表达模式分析

利用STEM技术，根据基因表达模式对BK0604、LK0901在不同时期的DEGs进行聚类。对BK0604而言，在4个时间点(接种后0、6、12、15d)共分化出20个变异模式，显著富集的聚类包括谱系0、2、4、14、17和19。对每个群集的基因进行功能富集分析，结果显示，谱系17和19在植物-病原体互作过程中显著富集。基于表达模式的分析，这两个类群的基因表达量在接种后立即增加或继续增加，这与预期的表达特征相吻合。

LK0901接种15天后全部死亡，因此，只有三个取样时间(0、6、12d)。聚类分析将3个取样时间点的DEGs划分为8个类群，其中谱系0、1、6和7显著富集。对得到的8个聚类进行KEGG注释，结果表明，谱系7的基因在植物-病原菌互作过程中显著富集。此外，这些基因的表达量在接种后逐渐增加。这些结果表明，无论是高抗苦瓜品种还是高感枯骨品种，被病原菌侵染后都能诱导相应的互作基因表达，但在调控途径上可能存在一定的差异。

2.5枯萎病菌接种后苦瓜生理生化影响

参照图4-图8，接种后苦瓜植株产生了一系列的生理生化变化，如活性氧含量，PAL活性，活性氧含量与植物-病原菌互作途径相关，PAL活性与苯丙素生物合成及苯丙氨酸代谢途径相关。结果表明，BK0604在接种后5～9天内超氧阴离子(O

2.6超微结构的变化

接种9天后，在木质部和韧皮部之间开始出现形成层细胞。在接种后12和17天，BK0604受病原菌影响较小，生长较好，形成层周围有少量次生木质部分化。相反，LK0901的次生结构几乎停止生长，木质部边界清晰。此外，相邻部分薄壁细胞间间隙逐渐增大，BK0604木质部比例大于LK0901。从叶片的微观结构来看，BK0604接种后发受影响较小。接种后第9天，LK0901叶绿体逐渐减少，栅栏组织的细胞形态变得不规律。接种第12和17天，栅栏状叶绿体进一步减少，大部分细胞破裂。

为了解尖孢镰刀菌苦瓜专化型侵染后BK0604亚显微结构变化，对苦瓜根系组织病理学反应进行观察。接种前，细胞壁光滑，无菌丝生长。接种3天后，BK0604木质部导管中有少量菌丝，而LK0901木质部导管壁被菌丝覆盖。因此在接种后第3天，LK0901根系中致病菌菌丝侵染了维管束系统，且导管中出现了损失。接种后第6天，BK0604中部分导管被侵填体堵塞，而LK0901几乎没有发现侵填体。接种后9天，BK0604中部分导管壁侵填体完全堵塞，而LK0901部分薄壁细胞开始降解。接种后12天，BK0604仍可见少量菌丝，而LK0901部分薄壁细胞塌陷解体。接种后15天，BK0604中致病菌菌丝不断减少，而LK0901与接种后12天无显著差别。

2.7类苯基丙烷生物合成途径

上述结果表明，DEGs可能调控木质素的合成和积累，影响细胞壁的形成，在抗病作用中发挥关键作用。对苯丙素生物合成途径的进一步分析表明，BK0604和LK0901在接种后PAL、CYP73A、CCoMT、CAD和POD等多个基因的表达水平发生了显著变化。然而，这两种基因型苦瓜之间也存在差异。例如，一些4CL和HCT的同源基因在BK0604中没有明显变化，但在LK0901中表达水平发生了显著变化。从表达谱中可以看出，除POD外，这些基因主要分为两类：一种在接种后上调表达，另一种则下调表达。并且，4CL-1、2和HTC-3、4在接种前保持较高水平，接种6d后呈下降趋势(dpi)。高抗品种在12和15dpi时表达量恢复正常，而LK0901在12dpi时表达量仍呈下调趋势。因此，HCT-1和HCT-2可能是导致BK0604具有抗病性的关键基因。在BK0604中接种后，HCT-1和HCT–2表达量几乎没有变化，但在LK0901中却显著上调表达和下调表达，这可能与LK0901对病原菌的诱导有关。值得注意的是，本发明在该途径中筛选出了28个POD基因，这些基因在接种后发生了显著的变化。除POD-7和8外，其他POD基因的表达量在接种后均显著上调，这可能解释了前期实验结果中接菌后POD活性升高的原因。参照图11-图15。

2.8植物与病原体互作

在该途径中，钙离子通过CNGC通道进入细胞后，主要参与三个方面的调控。首先，一氧化氮(NO)含量通过CaLM/CML蛋白调控，可以增强细胞壁抵抗力。第二，钙离子调节CDPK及其下游Rboh的表达水平，从而影响活性氧(ROS)的含量。第三，激活MPK通路，诱导PR1等防御基因的表达。接种后，BK0604和LK0901两种基因型NO和ROS调控通路基因均有显著差异表达。而MPK通路的基因表达水平仅在抗病中显著上调。在BK0604中，BAK1基因显著上调，这可能会增强抗病品种BK0604跨膜钙离子的转运能力。而对LK0901而言，接种后FLS2基因表达量显著上调，可能调控ROS含量。

2.9qRT-PCR验证

我们使用qRT-PCR来验证RNA-seq数据的可靠性。结果显示与RNA-seq数据有90％的一致性(图10)。这一结果进一步证明了测序数据的高可靠性。图10 20个基因在2个苦瓜品系中的表达谱。(A)利用qRT-PCR检测BK0604基因表达谱(R)。(B)利用RNA-seq检测BK0604基因表达谱，用颜色条表示不同表达水平。(C)利用qRT-PCR检测BK0604基因表达谱(S)。(D)利用RNA-seq检测LK0901基因表达谱，用颜色条表示不同表达水平。*,**和***分别表示在0.05、0.01和0.001水平下显著差异。

本实施例以未接种苦瓜为对照，接种苦瓜为处理，分析两品种苦瓜根系基因序列，获得了抗(BK0604)、感(LK0901)苦瓜及接种后不同取样时间苦瓜差异表达基因。接15天后，BK0604全部存活，LK0901全部死亡。因此，在15天取样时，只取了BK0604、LK0901苦瓜的根系，即三个取样时间点。因此，BK0604、LK0901不同苦瓜基因型抗性差异显著，是筛选抗病基因的理想材料。抗病比较组RM-RI12比较组中DEGs数量少于RM-RI16比较组，但是感病比较组SM-SI6和SM-SI12比较组之间DEGs略有差异。

苦瓜根系的测序结果表明，在6dpi和12dpi(dpi为接种后天数)，BK0604根系中RM-R12比较组DEGs(差异表达基因)数量少于RM-RI6，LK0901根系中SM-SI6和SM-SI12之间DEGs数量略有不同。根据生理生化指标的测定结果，防御酶活性剧烈在3～9dpi(接种后3～9天)范围内。然而，高感组SM-SI12对照组中DEGs显著增加。透射电镜观察发现，LK0901根系木质部严重褐变，且部分组织波壁细胞塌陷、溶解。接种12天后，高感组SM-SI12有大量的DEGs，这可能是导致苦瓜幼苗逐渐枯萎死亡的原因。

表3枯萎病菌侵染对苦瓜叶片MDA含量变化的影响nmol·g

英文字母表示在0.05水平上同一时间时不同品种或处理方式间差异显著，希腊字母表示在0.05水平上同一品种同种处理方式不同时间差异显著。

木质素生物合成是植物抗真菌侵染的关键途径。接种尖孢镰刀菌后，木质素合成途径中的一些关键基因的表达水平发生了显著变化，说明这些基因在致病菌感染后激活并参与了胁迫反应。病原菌侵染诱导抗、感品种苦瓜中木质素合成。多个POD酶编码基因参与了木质素合成途径，与对照相(RM、SM)比，两种苦瓜植株的POD含量均显著增加。然而，BK0604与LK0901间木质素含量还是有明显的区别。抗、感苦瓜品种间木质素合成途径中某些基因表达也存在差异，比如4CL-1,2和HTC-3,4。接种后，BK0604木质素合成途径某些基因表达一直维持在较高水平，无明显变化。与之相反，接种后，LK0901品种木质素合成途径基因表达水平显著下降，这些基因可能是BK0604的抗病基因。这些基因的持续高表达可能促进了BK0604木质素的合成。接种后3～9天，PAL活性随着时间的延长显著提升，且BK0604显著高于LK0901和RM、SM。扫描电镜观察结果显示，接种后BK0604根系中形成较多的填充体，填充体的主要成分为木质素和纤维素，这表明在抗病品种中，一些木质素合成途径的相关基因一直保持的较高表达水平。

此外，这些DEGs在植物-病原菌互作途径中体现为显著富集。接种后，苦瓜可能会通过钙离子途径调节抵抗致病菌侵染。钙离子通过CNGC蛋白跨膜转运，进而参与三条通路的调控。首先，CaLM/CML通路可以介导NO来增强细胞壁抵抗能力，在抗、感苦瓜品系中发现该通路的CaLM/CML同源基因表达水平存在显著差异。第二，钙离子可以调控CDPK及其下游Rboh基因的表达，催化组织中ROS(活性氧)的生成，而FLS2在感病品种中差异表达显著。生理生化试验表明，接种后苦瓜超氧阴离子

在上述试验的基础上，本发明提出木质素合成和MAPK信号通路在增强苦瓜抗枯萎病的应用。

特别地是，通过控制PAL,CYP73A,CCoMT,CAD和POD基因持续高表达促进了BK0604木质素的合成。

特别地是，通过CaLM/CML通路介导NO来增强细胞壁抵抗能力，促进CaLM/CML同源基因表达水平来提高苦瓜抗病能力。

特别地是，通过钙离子调控CDPK及其下游Rboh基因的表达，催化组织中ROS(活性氧)的生成，通过抑制FLS2的表达来抑制ROS产量的快速增加。FLS2可与BAK1形成复合体，这可以将病原体相关的分子模式信号感知与转导联系起来。

特别地是，通过钙离子激活MPK通路，诱导防御相关基因的表达。

本发明在于提供一种增强苦瓜抗枯萎病能力的方法，通过施加促进木质素合成的肥料或促进剂来增强苦瓜抗枯萎病能力。