一种高效表达猪HIF-1α基因的真核表达载体及其构建方法

摘要

本发明涉及一种高效表达猪

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种高效表达猪HIF-1α基因的真核表达载体及其构建方法。

背景技术

HIF-1α基因属HIF家族成员，HIF1是由HIF-1α和HIF-lβ两个亚基组成的异源二聚体，α亚基在乏氧和常氧条件下反应不同，最新研究表明HIF在炎症反应中也发挥重要作用。目前，有关HIF-1α基因的报道多集中在人药物代谢和肿瘤发生过程，通过酶活性、mRNA表达和基因水平探讨HIF-1α调控恶性肿瘤糖代谢的机理，揭示HIF-1α能对细胞环境中可用氧的变化做出反应，尤其是对氧气的减少或缺氧做出反应。而对猪HIF-1α基因的研究报道少见。有关猪HIF-1α基因的功能并不仅限于代谢酶类，HIF-1α调控着40多种基因的转录，包括促红细胞生成素、葡萄糖转运蛋白、糖酵解酶、血管内皮生长因子和其它基因蛋白产物能增加氧输送或促进缺氧新陈代谢。申请人团队在前期研究中发现，猪HIF-1α基因在疫病感染炎性反应过程中表达显著改变，并与炎性反应关系密切，预示猪HIF-1α基因在炎性反应调控中可能发挥一定作用，而构建猪HIF-1α基因真核表达载体是探讨猪该基因分子功能的前提。因此，本发明提供一种高效表达猪HIF-1α基因的真核表达载体构建方法，可实现猪HIF-1α基因在细胞甚至活体水平高效表达，为进一步探讨猪HIF-1α基因在生理代谢、免疫反应等方面的分子机能和调控途径提供了方便与可能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效表达猪HIF-1α基因的真核表达载体及其构建方法，包含用于高效、特异克隆猪HIF-1α基因的特异引物，特异扩增片段的粘性末端处理，实现高效表达真核载体的选择。构建的高效表达猪HIF-1α基因的真核载体转化进目标细胞或活体，将极大地促进研究者对猪HIF-1α基因结构、功能及分子机理的探究。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种高效表达猪HIF-1α基因的真核表达载体构建方法，包括以下步骤：

1)猪HIF-1α基因的克隆

以健康猪肺组织为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以GenBank中猪HIF-1α基因cDNA序列NCBI Reference Sequence:NM_001123124.1为模板设计引物，设计包含特异酶切位点和保护碱基的特异引物，应用Primer STARMax高保真酶对猪HIF-1α基因编码序列进行PCR扩增，扩增片段包含猪HIF-1α基因cDNA序列2475bp，酶切位点及保护碱基18bp，片段总长2493bp，猪HIF-1α基因cDNA序列如SEQ ID NO.1所示；

2)真核表达载体pcDNA3.1(+)-HIF-1α的构建

将HIF-1α基因连接到pMD18T载体中，转化至DH5α大肠杆菌，提取菌株中pMD18T-HIF-1α重组质粒，KpnI/XhoI双酶切鉴定后回收HIF-1α基因片段，同时用KpnI/XhoI双酶切处理pcDNA3.1(+)载体质粒，利用T4连接酶与回收的HIF-1α基因片段进行连接后，转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞，提取阳性质粒，测序验证，高效表达猪HIF-1α基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HIF-1α构建成功。

设计的特异引物如下：

上游引物HIF-1α-F：5'-CGG

下游引物HIF-1α-R：5'-CCG

进一步的，PCR扩增目的片段回收、纯化后，使用Taq酶进行加A尾处理，PCR产物14.5μL，Taq buffer 2.0μL，dNTP 3μL，5U/μL Taq polymerase 0.5μL，72℃孵育20min，-20℃保存备用，便于克隆载体构建。

所述的高效表达猪HIF-1α基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HIF-1α在研究病毒感染巨噬细胞后的炎症反应中具有重要作用，可以在制备功能药物中得到应用，特别是指在制备与炎性反应相关的功能药物中应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明针对猪HIF-1α基因的分子机能研究，提供了一种高效表达猪该基因的真核表达载体的构建方法，用于细胞及活体水平的猪HIF-1α基因代谢调控、免疫反应等生物学功能研究与验证，具很好的实际意义和应用价值，目前未见其它报道。

本发明通过研究，确定了适合猪HIF-1α基因特异克隆并利于载体构建的特异引物，优化了载体构建的处理手段与条件，明确了适合猪HIF-1α基因功能研究的质粒载体。

针对猪HIF-1α基因具药物代谢酶功能，特别选用pcDNA3.1(+)作为真核质粒载体，利用其高效增强子SV40及高效启动子CMV，促进HIF-1α基因高效表达。

应用本发明阐述的方法构建出的高效表达猪HIF-1α基因的真核表达载体，转染猪PAM细胞，建立起表达猪HIF-1α基因PAMs细胞系，用于PRRSV的巨噬细胞感染实验，通过对炎性反应调控通路关键受体及炎性因子表达水平的动态监测，发现在PRRSV的巨噬细胞的炎性反应过程中，猪HIF-1α基因与促炎因子TNF-α和IL-6、mRNA的表达情况存在明显的正相关，影响机体炎性反应过程，发挥致炎作用。这一重大发现对猪HIF-1α基因的分子功能研究具有深远的意义，更能有效促进PRRSV的巨噬细胞的炎性反应过程的分子基础研究工作。而且，应用该高效表达猪HIF-1α基因真核表达载体转染其它相关功能细胞，甚至活体猪特定组织部位，开展细胞代谢、病原感染，以及活体转基因实验，能为进一步揭示猪HIF-1α基因的生物学功能提供可能和技术支撑，有益效果显著。

附图说明

图1为猪HIF-1α基因真核表达载体示意图。

图2为猪HIF-1α基因扩增及克隆载体构建效果图。

其中，A：猪HIF-1α基因PCR扩增结果示例HIF-1α；B：猪HIF-1α基因真核表达载体酶切鉴定结果。

图3为猪HIF-1α基因真核表达载体转染3D4/21细胞后表达效果鉴定。

图4为猪HIF-1α基因真核表达载体转染3D4/21细胞后对PRRSV复制的影响。

图5为pcDNA3.1(+)-HIF-1α对3D4/21细胞TNF-α和IL-6mRNA表达的作用；

其中，*表示与正常对照组差异显著(0.01

图6为pcDNA3.1(+)-HIF-1α对3D4/21细胞TNF-α和IL-6分泌的作用；

其中，*表示与正常对照组差异显著(0.01

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。本实施例仅用于说明本发明但不用于限制本发明范围。实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件进行，如分子克隆实验手册所述条件或制造厂商建议条件。

实施例1高效表达猪HIF-1α基因真核表达载体的构建

1.猪HIF-1α基因克隆

健康猪屠宰取，肺组织样品，提取总RNA，超微量分光光度计检测RNA纯度及浓度，反转录合成cDNA。以GenBank中猪HIF-1α基因cDNA序列(NCBIReference Sequence:NM_001123124.1)为模板设计引物，为便于构建重组载体，在引物上游序列添加KpnI酶切位点(GGTACC)及三个保护碱基(CGG)，下游序列添加XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)和三个保护碱基(CCG)，构成特异引物，以反转录cDNA为模板，PrimerSTAR高保真酶扩增HIF-1α基因，目的片段长度2493b(包含2475bp的猪HIF-1α基因cDNA序列，见SEQ ID NO.1，18bp的酶切位点和保护碱基)；PCR扩增体系(50μL)：10×PCR buffer 5μL，2mM/L dNTPs 5μL，25mM/L MgCl

上游引物HIF-1α-F：5'-CGG

下游引物HIF-1α-R：5'-CCG

2.猪HIF-1α基因真核表达载体的构建

目的片段回收纯化后，使用Taq酶加A尾制造粘性末端：PCR产物14.5μL，Taqbuffer 2.0μL，dNTP 3μL，5U/μL Taq polymerase 0.5μL，72℃孵育20min，-20℃保存备用。处理后的目的基因片段与pMD18T载体连接：纯化DNA 4μL，pMD18T 1μL，ddH2O 1μL，Solution I 6μL，16℃连接过夜，构建pMD18T-HIF-1α克隆载体；将克隆载体转化进DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆摇菌12小时，菌液PCR鉴定、测序，后经KpnⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定，酶切反应体系为(30μL)：重组质粒DNA 20μL，10xBuffer H 3μL，KpnⅠ/XhoⅠ2.5μL，ddH2O 2μL。

将酶切后的重组质粒与pcDNA3.1(+)载体进行琼脂糖凝胶电泳，分别回收纯化目的基因片段与pcDNA3.1(+)载体片段，用T4连接酶连接，连接体系(20μL)：10xBuffer 2μL，回收的线性HIF-1α基因12μL，回收的线性pcDNA3.1(+)3μL，T4DNA连接酶lμL，ddH2O 2μL；然后，将重组载体转化进DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆摇菌12小时，小量提取质粒酶切验证，菌液PCR验证并测序鉴定，无内毒素大量提取质粒，操作方法按照Omega公司无内毒素质粒提取试剂盒(E.Z.N.A.EndoFee Plasmid Mini Kit)的说明书进行。用超微量分光光度计检测重组真核载体的纯度及浓度，限制性内切酶KpnⅠ/XhoⅠ对重组真核载体质粒进行双酶切(酶切反应同上重组质粒酶切反应体系)，1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2B。。

实施例2 pcDNA3.1(+)-HIF-1α真核表达载体转染猪PAM细胞表达效果验证

将PAM细胞的传代细胞系3D4/21细胞复苏后接种于六孔板，以含10％胎牛血清1％双抗的完全1640培养基培养24h，当贴壁程度达到80％时，用转染试剂LipofectmineTM3000分别将pcDNA3.1(+)-HIF-1α质粒、pcDNA3.1(+)质粒以每孔2.5μL转染入3D4/21细胞，用DMEM完全培养液(购自培源生物技术有限公司)培养48小时，收取细胞样品。Westernblotting检验细胞内HIF-1α蛋白表达，结果见图3，HIF-1α转染后3D4/21细胞内表达量显著升高。高效表达猪HIF-1α基因的3D4/21细胞系可用于后续的病原感染后细胞内氧化磷酸化转为有氧糖酵解的研究等，研究猪HIF-1α基因在糖代谢、炎症反应等方面的分子机能和调控途径。

实施例3 PRRSV感染过表达猪HIF-1α基因的PAM细胞系实验

取生长状态良好的3D4/21细胞接种到6孔细胞培养板中，调节每孔细胞密度为10

β-Actin-F:5'-CTCCATCATGAAGTGCGACGT-3'(SEQ ID NO.4)

β-Actin-R:5'-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3'(SEQ ID NO.5)

TNF-α-F:5'-CCCCCAGAAGGAAGAGTTTC-3'(SEQ ID NO.6)

TNF-α-R:5'-CGGGCTTATCTGAGGTTTGA-3'(SEQ ID NO.7)

IL-6-F:5'-TGACGCCTGGAAGAAGAT-3'(SEQ ID NO.8)

IL-6-R:5'-TGAACCCAGATTGGAAGC-3'(SEQ ID NO.9)

PRRSV-F:5'-AAACCAGTCCAGAGGCAAGG-3'(SEQ ID NO.10)

PRRSV-R:5'-TCAGTCGCAAGAGGGAAATG-3'(SEQ ID NO.11)

qPCR的结果采用相对定量2-ΔΔC法计算目标基因表达水平，SPSS软件统计分析，并进行独立样本t检验，P<0.05和P<0.01表示统计学差异。结果如图4所示：与正常组PAM细胞相比，猪HIF-1α基因过表达组PRRSV的表达量无明显差异，实验结果表明HIF-1α不影响PRRSV的吸附、感染和增殖。HIF-1α对炎症细胞因子mRNA表达的影响如图5所示，与正常组PAM细胞相比，猪HIF-1α基因过表达组的TNF-αmRNA极显著升高(P<0.01)，IL-6mRNA极显著升高(P<0.01)，该结果表明HIF-1α对TNF-α和IL-6mRNA表达具有促进作用。HIF-1α对炎症细胞因子分泌的影响如图6所示，与正常组PAM细胞相比，猪HIF-1α基因过表达组细胞上清液中的TNF-α显著升高(P<0.05)，IL-6显著升高(P<0.05)，该结果表明HIF-1α对TNF-α和IL-6分泌具有促进作用。

本实施例通过构建猪HIF-1α基因真核表达载体，以及HIF-1α基因过表达PAM细胞系，用于PRRSV体外感染实验，揭示了PRRSV通过猪HIF-1α基因与促炎因子TNF-α和IL-6协同调控炎性反应的关系，这一创新性发现为猪HIF-1α基因的分子功能研究提供了新的思路和可能，目前未见这方面报道。

综上所述，本发明构建了高效表达猪HIF-1α基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HIF-1α，用于载体构建的猪HIF-1α基因克隆特异引物和载体构建过程中特殊处理方式，所选pcDNA3.1(+)载体的高效增强子SV40及高效启动子T7PCMV均为转染后猪HIF-1α基因的高效表达提供了可能，本发明涉及的猪HIF-1α基因真核表达载体构建方法也为首次报道，构建的载体用于后续研究，首次揭示了猪HIF-1α基因与促炎因子TNF-α和IL-6协同调控炎性反应的关系，为进一步发掘猪HIF-1α基因的生物学功能提供了可能和技术支撑。