HIF-1α基因真核表达载体的构建及其在肿瘤细胞凋亡中的作用

摘要

研究背景：缺氧诱导因子-1是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子,可调节多种靶基因如血管内皮生长因子(VEGF),红细胞生成素(EPO)等的表达,它的活性对维持肿瘤细胞的能量代谢、促进血管生成及抑制细胞凋亡起着重要作用。研究缺氧诱导因子对肿瘤细胞生长和凋亡的影响,对于进一步阐明肿瘤发生、发展规律,探索肿瘤治疗的新靶点有着重要意义。
　　 目的:通过构建HIF-1α-pcDNA3.1(+)真核表达载体,转染细胞来研究HIF-1对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。
　　 方法：从乳腺癌细胞MDA-MB-231中提取HIF-1α mRNA为模版,逆转录得到cDNA,PCR扩增HIF-1α目的基因,连接到pMD18-T载体中,测序验证,双酶切将HIF-1α转至pcDNA3.1(+)中。采用阳离子脂质体法将表达载体转入SK-BR-3细胞,用Western Blot检测HIF-1α的表达情况,记录生长曲线,结合Hoechest凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。
　　 结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示RT-PCR扩增出的特异片段2749bp,基因测序结果与GeneBank报道的完全一致,表明成功构建了HIF-1α-pcDNA3.1(+)真核表达载体。质粒HIF-1α-pcDNA3.1(+)转染SK-BR-3细胞24h后,取出细胞粘片,置于载玻片上,荧光倒置显微镜下观察估计其转染效率约为20％。经Western Blot检测转染后实验组SK-BR-3的HIF-1α的表达增强,连续9天的细胞计数细胞生长较对照组旺盛,Hoechest凋亡检测发现中晚期细胞凋亡数比对照组少。
　　 结论：HIF-1有抑制肿瘤细胞凋亡和促进肿瘤细胞生长的作用。