NPEPL1基因突变体及其在掌跖角化症诊断中的应用

摘要

本发明公开了一种NPEPL1基因突变体，NPEPL1基因突变体的DNA序列与SEQ IDNO：1相比，具有c.507+713A>G、c507+590‑507+592delTGT、c507+689‑507+692delTGTT突变中的任意一种或任意两种的组合，公开了NPEPL1基因突变体在掌跖角化症诊断中的应用，能够缩小检测范围，降低患者的经济负担；公开了用于检测NPEPL1基因突变体的试剂盒及其使用方法。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种NPEPL1基因突变体及其在掌跖角化症诊断中的应用。

背景技术

长岛型掌跖角化症又称Nagashima掌跖角化症，其遗传模式是常染色体隐性遗传，纯合子或复合杂合子可以引起掌跖角化过度关键致病基因突变。Nagashima掌跖角化症的主要临床表现为手、足背、前臂、肘部、跟腱和膝盖部位弥漫性红斑，边界清晰。因其临床表型和遗传特点，严重影响患者的生存质量，作为一种单基因遗传病，致病突变的发现，对于患者优生优育有着重要的指导意义。

目前研究已经发现SERPINB7基因(丝氨酸蛋白酶抑制剂B7基因)多个突变可以导致Nagashima掌跖角化症的发生，在发现的突变位点中，除了外显子突变，部分患者还存在内含子变异，比如c.455-1G>A和c.336+2T>G，这可能导致SERPINB7基因功能改变，从而引起Nagashima掌跖角化症的致病。但在临床就诊的患者中，很多高度疑似Nagashima掌跖角化症的患者并未检测出致病突变，对于此类患者在中国人群以及亚洲人群的尚未明确的指导，传统方式会进行所有皮肤遗传病致病基因的筛查，给患者造成了巨大的经济负担。同时，此类患者可能存在其他致病基因的突变，且可能存在于不限于外显子，比如内含子区域。NPEPL1基因(氨肽酶类蛋白-1)位于20号染色体上，位于Syntaxin16基因又称STX16(突触融合蛋白16基因)和鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)基因之间，并广泛表达于全身88个组织和器官。在全基因组检测数据中发现NPEPL1基因中有3个内含子突变，在不同Nagashima掌跖角化症患者中以单个或两个突变位点组合的方式出现。因此，为实现大量患者精准诊断，让患者在诊疗中少走弯路，进而减轻患者的经济负担。本发明整理了全基因组测序发现的NPEPL1基因的三个有意义的内含子突变位点，并设计一个检测诊断试剂盒。若Nagashima掌跖角化症患者携带单个或两个突变位点，则在众多类型的掌跖角化症的诊断中，可以优先考虑Nagashima掌跖角化症。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种NPEPL1基因突变体，与野生型NPEPL1基因相比，NPEPL1基因突变体具有c.507+713A>G、c507+590-507+592delTGT、c507+689-507+692delTGTT突变中的任意一种或任意两种的组合；

本发明还有一个目的是提供一种NPEPL1基因突变体在诊断掌跖角化症诊断中的应用，与野生型基因相对比，通过基因测序检测NPEPL1基因突变体具有c.507+713A>G、c507+590-507+592delTGT、c507+689-507+692delTGTT突变中的任意一种或任意两种的组合，则在众多类型的掌跖角化症的诊断中，可以优先考虑Nagashima掌跖角化症；

本发明还有一个目的是提供一种用于检测NPEPL1基因突变体的试剂盒，通过检测患者是否携带本发明中涉及的NPEPL1基因中3个基因组突变位点，进而诊断患者是否为Nagashima掌跖角化症。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供一种NPEPL1基因突变体，NPEPL1基因突变体的DAN序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.507+713A>G、c507+590-507+592delTGT、c507+689-507+692delTGTT突变中的任意一种或任意两种的组合。

NPEPL1基因突变体在掌跖角化症诊断中的应用。

一种用于检测NPEPL1基因突变体的试剂盒，包括上游引物、下游引物。

优选的是，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2；所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

优选的，还包括多个孔板，每个孔板内放置反应体系。

优选的，所述反应体系的体积为5μL。

优选的，所述反应体系包括：20-50ng DNA、0.5pmoL上游引物、0.5pmoL下游引物、0.1μL的25mM dNTPs。

优选的，还包括ABI3730测序平台。

本发明至少包括以下有益效果：

第一、本发明提供一种NPEPL1基因突变体，与野生型NPEPL1基因相比，NPEPL1基因突变体具有c.507+713A>G、c507+590-507+592delTGT、c507+689-507+692delTGTT突变中的任意一种或任意两种的组合；

第二、本发明提供一种NPEPL1基因突变体在诊断掌跖角化症诊断中的应用，与野生型基因相对比，通过基因测序检测NPEPL1基因突变体具有c.507+713A>G、c507+590-507+592delTGT、c507+689-507+692delTGTT突变中的任意一种或任意两种的组合，则在众多类型的掌跖角化症的诊断中，可以优先考虑Nagashima掌跖角化症，采用这种方式检测是否是Nagashima掌跖角化能够缩小检测范围，降低患者的经济负担；

第三、本发明提供一种用于检测NPEPL1基因突变体的试剂盒，通过检测患者是否携带本发明中涉及的NPEPL1基因中3个基因组突变位点，进而诊断患者是否为Nagashima掌跖角化症。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为病例1的Nagashima掌跖角化症家系图；

图2为图1中的I-2和II-2的突变图；

图3为图1中的II-2的模式图；

图4为病例2的Nagashima掌跖角化症家系图；

图5为图4中的II-1和I-1突变图；

图6为病例3的Nagashima掌跖角化症家系图；

图7为图6的I-1和II-1的突变图；

图8为图6的II-1的模式图。

注：

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本申请的实施例提供了一种NPEPL1基因突变体，NPEPL1基因突变体的DNA序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.507+713A>G、c507+590-507+592delTGT、c507+689-507+692delTGTT突变中的任意一种或任意两种的组合，即NPEPL1基因突变体的DNA序列可能是c.507+713A>G，c507+590-507+592delTGT，c507+689-507+692delTGTT，c.507+713A>G、c507+590-507+592delTGT，c.507+713A>G、c507+689-507+692delTGTT，c507+590-507+592delTGT、c507+689-507+692delTGTT中的任意一种。

提供了一种NPEPL1基因突变体在掌跖角化症诊断中的应用，在进行基因测序后，发现NPEPL1基因突变体为c.507+713A>G，c507+590-507+592delTGT，c507+689-507+692delTGTT，c.507+713A>G、c507+590-507+592delTGT，c.507+713A>G、c507+689-507+692delTGTT，c507+590-507+592delTGT、c507+689-507+692delTGTT任意一种突变，则在众多类型的掌跖角化症的诊断中，可以优先考虑Nagashima掌跖角化症，采用这种方式检测是否是Nagashima掌跖角化症能够缩小检测范围，降低患者的经济负担。

提供了用于检测NPEPL1基因突变体的试剂盒，包括上游引物、下游引物。

在另一些技术方案中，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2；所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

在另一种技术方案中，还包括多个孔板，每个孔板内放置反应体系。

在另外一种技术方案中，所述反应体系的体积为5μL。

在另一种技术方案中，所述反应体系包括：20-50ng DNA、0.5pmoL上游引物、0.5pmoL下游引物、0.1μL的25mM dNTPs。

在另一种技术方案中，还包括ABI3730测序平台。

关于用于检测NPEPL1基因突变体的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1、使用EDTA抗凝管采集患者2mL血液，利用商品化试剂盒从血液中提取基因组DNA，提取的DNA利用分光光度计定量、琼脂糖凝胶电泳质检DNA质量，质量合格的DNA将浓度调整到50ng/μL，-20℃存储备用。

S2、PCR扩增采用多重PCR技术，在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5uL。每个反应体系包括：20-50ng DNA、0.5pmoL上游引物、0.5pmoL下游引物、0.1μL的25mM dNTP。PCR反应条件为：94℃4min；94℃20s，56℃30s，72℃1min，45个循环；72℃3min；4℃保持。

S3、基于ABI3730测序平台，对所述PCR扩增产物进行测序分析，利用软件读取NPEPL1基因的测序峰图，以评估测试者是否存在NPEPL1基因突变。

S4、通过步骤S4进行分析后，对患者提供诊断报告以及疾病诊断意见。

<病例1>

如图1-3所示，图1为Nagashima掌跖角化症家系图，II-2为先证者，先证者同时存在c.507+713A>G纯合突变和c507+590-507+592delTGT为杂合突变，其弟弟出现相同的突变，患者母亲及儿子未发病，仅出现c.507+713A>G杂合；图2为突变图，从图2可以看出II-2先证者具有c507+590-507+592delTGT杂合突变；先证者母亲未出现c507+590-507+592delTGT突变；图3为模式图，模式图为先证者在20号染色体中，NPEPL1基因的内含子区域c507+590到507+592出现TGT碱基缺失图。

<病例2>

如图4-5所示，图4为Nagashima掌跖角化症家系图，II-1为先证者，先证者出现c.507+713A>G纯合突变，其弟弟出现相同的突变，患者父亲及母亲出现c.507+713A>G杂合突变；图5为突变图，从图5可以看出II-1先证者出现c.507+713A>G纯合突变，I-1为患者母亲出现c.507+713A>G杂合突变。

<病例3>

如图6-8，图6为Nagashima掌跖角化症家系图，II-1为先证者，先证者同时存在c.507+713A>G杂合突变和c.507+689-507+692delTGTT为杂合突变，其父亲出现c507+689-507+692delTGTT杂合突变，图7为突变图，从图7可以看出II-1先证者具有c.507+689-507+692delTGTT杂合突变；I-1先证者母亲未出现c.507+689-507+692delTGTT突变；图8为模式图，模式图为先证者在20号染色体中，NPEPL1基因的内含子区域c.507+689到507+692出现TGTT碱基缺失图。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。