IPO7在结直肠癌治疗及预后预测中的应用

摘要

本发明公开了IPO7在结直肠癌治疗及预后预测中的应用，本发明提供了一种诊断结直肠癌/诊断结直肠癌转移/预测结直肠癌预后的产品，本发明还提供了一种治疗结直肠癌的药物组合物。本发明通过广泛而深入的实验，证明了IPO7能够有效诊断结直肠癌和结直肠癌的转移并且能够有效地预测结直肠癌的预后，通过增殖、迁移、侵袭、凋亡和分裂实验，证明抑制IPO7的表达能够起到治疗结直肠癌的效果。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及IPO7在结直肠癌治疗及预后预测中的应用。

背景技术

结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）已成为世界范围第三大恶性肿瘤，发病率仅次于肺癌和女性乳腺癌，在2020年已成为导致癌症相关死亡的第二大原因。由于结直肠癌起病隐匿，早期常无特异的症状和体征，多数患者就诊时已处于中晚期，甚至已发生全身多处转移，丧失了手术治疗的机会，是结直肠癌致死的主要原因。即使手术治疗后，患者预后差异非常显著。因此，为了对患者制定综合性、个体化治疗方案，提高患者预后水平，寻找有效的影响结直肠癌诊断和预后的分子标志物和特定的药物靶点很有必要。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种分子标志物IPO7，能够实现结直肠癌的诊断、转移诊断、治疗及预后预测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种诊断结直肠癌/诊断结直肠癌转移/预测结直肠癌预后的产品，所述产品包括能够检测IPO7表达水平的试剂。

进一步，所述试剂选自特异性识别IPO7基因的寡核苷酸探针、特异性扩增IPO7基因的引物或特异性结合IPO7基因编码的蛋白的结合剂。

进一步，所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。

本发明的第二方面提供了一种用于治疗结直肠癌的药物组合物，所述药物组合物包括IPO7的抑制剂。

进一步，所述抑制剂抑制结直肠癌的增殖、迁移、侵袭、凋亡和/或分裂。

进一步，所述抑制剂包括核酸抑制剂、蛋白抑制剂。

本发明的第三方面提供了一种筛选治疗结直肠癌的候选药物的方法，所述方法包括：用待筛选物质处理表达或含有IPO7基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中IPO7基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质抑制IPO7基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗结直肠癌的候选药物。

本发明的第四方面提供了一种诊断结直肠癌/诊断结直肠癌转移/预测结直肠癌预后的系统/装置，所述系统/装置包括：

获取单元：用于获取样本中IPO7的表达水平；

处理单元：根据IPO7的表达情况，获得结直肠癌的诊断/诊断转移/预后预测结果。

本发明的第五方面提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现本发明第四方面所述的系统/装置。

本发明的第六方面提供了如下任一项应用：

（1）IPO7的抑制剂或本发明第二方面所述的药物组合物在制备治疗结直肠癌的产品中的应用；

（2）检测IPO7表达水平的试剂或本发明第一方面所述的产品在制备诊断结直肠癌/诊断结直肠癌转移/预测结直肠癌预后的工具中的应用；

（3）IPO7在筛选治疗结直肠癌的候选药物中的应用；

（4）IPO7在促进巨噬细胞分化中的应用；

（5）IPO7在构建诊断结直肠癌/诊断结直肠癌转移/预测结直肠癌预后的系统/装置中的应用；

（6）IPO7在构建诊断结直肠癌/诊断结直肠癌转移/预测结直肠癌预后的计算机可读存储介质中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供的分子标志物IPO7能够有效诊断结直肠癌和结直肠癌的转移，可以通过抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡和分裂，进而达到治疗结直肠癌的目的，此外，IPO7也能很好的预测结直肠癌的预后。

附图说明

图1是蛋白表达差异火山图，其中，1A是结直肠癌原发灶与正常组织的蛋白表达差异图，1B是结直肠癌肝转移灶与原发灶的蛋白表达差异图；

图2是各组共同上调/下调蛋白的韦恩图；

图3是IPO7在结直肠正常组织、原发灶、肝转移灶中的蛋白表达差异图，其中，3A是免疫组化染色结果图，3B是免疫组化评分统计图；

图4是IPO7在结直肠癌及癌旁的蛋白表达差异图，其中，4A是免疫组化染色结果图，4B是免疫组化评分统计图；

图5是IPO7与结直肠癌患者总体生存率关系图；

图6是IPO7敲低效率的检测及稳转细胞株的构建图，其中，6A是siRNA在DLD1中对IPO7的敲低效率图，6B是稳转细胞系中IPO7的mRNA表达水平图，6C是稳转细胞系中IPO7的蛋白免疫印迹图，6D是慢病毒转染的敲低IPO7的稳转细胞系图；

图7是敲低IPO7对DLD1细胞的增殖影响图；

图8是敲低IPO7对DLD1细胞的克隆形成能力影响图，其中，8A是克隆形成能力图，8B是克隆形成统计图；

图9是敲低IPO7对DLD1细胞的迁移能力影响图，其中，9A是划痕愈合情况图，9B是24h伤口愈合率统计图，9C是48h伤口愈合率统计图；

图10是敲低IPO7对DLD1细胞的迁移和侵袭能力影响图，其中，10A是DLD1细胞迁移能力图，10B是DLD1细胞迁移能力统计图，10C是DLD1细胞的侵袭能力图，10D是DLD1细胞的侵袭能力统计图；

图11是敲低IPO7对DLD1细胞周期影响图，其中，11A是shNC在不同阶段细胞的分布比例图，11B是shIPO7-1在不同阶段细胞的分布比例图，11C是shIPO7-2在不同阶段细胞的分布比例图，11D是G1期细胞分布统计图，11E是G2期细胞分布统计图，11F是S期细胞分布统计图；

图12是敲低IPO7对DLD1细胞的凋亡影响图，其中，12A是shNC在不同凋亡阶段细胞的分布比例图，12B是shIPO7-1在不同凋亡阶段细胞的分布比例图，12C是shIPO7-2在不同凋亡阶段细胞的分布比例图，12D是早期凋亡细胞分布统计图，12E是晚期凋亡细胞分布统计图；

图13是IPO7与巨噬细胞浸润相关性图，其中，13A是IPO7低表达与巨噬细胞浸润相关性图，13B是IPO7高表达与巨噬细胞浸润相关性图。

具体实施方式

下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。

本发明提供了一种诊断结直肠癌/诊断结直肠癌转移/预测结直肠癌预后的产品，所述产品包括能够检测IPO7表达水平的试剂。

IPO7包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的IPO7，以及源自细胞中加工的任何形式的IPO7。该术语涵盖IPO7的天然发生变体（例如剪接变体或等位变体）。该术语涵盖例如人的IPO7以及来自任何其它脊椎动物来源的IPO7，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物（例如小鼠和大鼠）的IPO7，基因ID:10527。

在本发明中，诊断及其术语的变化型是指基于与个体相关的一个或其以上的征兆、症状、数据或其他信息，来对个体的健康状态或状况的发现、判断或认知。个体的健康状态可被诊断为健康的/正常的（即，不存在疾病或疾患），或者可被诊断为不健康的/异常的（即，存在疾病或疾患或特性的评估）。上述术语诊断及其术语的变化型包括与特定疾病或疾患相关地，疾病的早期发现；疾病的特性或分类；疾病的进展、治愈或复发的发现；个体的处置或治疗后，对疾病的反应的发现。

在本发明中，转移是指其中起源于一个器官或身体的一部分的癌细胞在有或无体液的运输下迁移到身体的另一个部分并且继续重复的过程。转移的细胞可以随后形成可以进一步转移的肿瘤。转移因此称为癌症的扩散，从它最初发生的身体的部分扩散到身体的其他部分。

在本发明的实施方案中，转移是指结直肠癌的肝转移。

在本发明中，预后是指关于医学发展（例如，长期存活可能性、无疾病存活率等）的预期，包括积极预后或消极预后，所述消极预后包括疾病进展如复发，结直肠癌生长、转移和耐药死亡率，积极预后包括疾病缓解如无疾病状态，疾病改善如结直肠癌消退或稳定。

在本发明中，表达水平或表达的水平一般指生物学样品中生物标志物的量。表达一般指信息（例如基因编码和/或表观遗传信息）转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，如本发明中使用的，表达可以指转录成多核苷酸，翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰（例如多肽的翻译后修饰）。转录的多核苷酸的，翻译的多肽的或多核苷酸和/或多肽修饰（例如多肽的翻译后修饰）的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自多肽的翻译后加工（例如通过蛋白水解）。表达的基因包括转录成多核苷酸（如mRNA），然后翻译成多肽的基因，还有转录成RNA但不翻译成多肽的基因（例如转运和核糖体RNA）。

进一步，所述检测IPO7表达水平的试剂选自特异性识别IPO7基因的寡核苷酸探针、特异性扩增IPO7基因的引物或特异性结合IPO7基因编码的蛋白的结合剂。

在本发明中，探针指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，探针通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸（往往称为靶多核苷酸）结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式包括但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

在本发明中，引物指短核酸序列，作为具有短的游离3’末端羟基（游离3’羟基）的核酸序列，它可以与互补模板（template）形成碱基对（basepair）并充当复制模板的起点。

在本发明中，结合剂指特异性结合靶的天然存在的或非天然存在的分子。特异性结合剂的实例包括但不限于蛋白、肽、核酸、碳水化合物和脂质。

在本发明中，特异性结合IPO7基因编码的蛋白的结合剂例如蛋白质IPO7的受体、结合蛋白质IPO7的凝集素、针对蛋白质IPO7的抗体、针对蛋白质IPO7的肽抗体（peptidebody）、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。特异性结合剂的具体例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。

进一步，所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。

在本发明中，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测IPO7基因转录水平的针对IPO7基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括IPO7蛋白的特异性结合剂；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测IPO7基因转录水平的试剂或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测IPO7蛋白表达水平的试剂或芯片。

在本发明中，试剂盒是指在用于对核苷酸进行测序和/或分离核苷酸序列和/或基于来自样品或细胞的表达核苷酸序列的存在、不存在和/或量来诊断患有疾病或感染的受试者的系统的情况下提供的一组组件。

所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测IPO7基因转录水平的试剂或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测IPO7蛋白表达水平的试剂或芯片。

本发明的试剂盒包括以下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

本发明中所述的芯片、试剂盒或膜条可用于检测包括IPO7基因或蛋白在内的多个基因或蛋白及其表达产物（例如，结直肠癌相关的多个基因或蛋白）的表达水平。将结直肠癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高结直肠癌诊断或预后预测的准确率。

本发明提供了一种用于治疗结直肠癌的药物组合物，所述药物组合物包括IPO7的抑制剂。

在本发明中，抑制剂是指任何可减少IPO7蛋白的活性、降低IPO7基因或蛋白的稳定性、下调IPO7蛋白的表达、减少IPO7蛋白有效作用时间或抑制IPO7基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调IPO7有用的物质，从而可用于预防或治疗结直肠癌。

在本发明中，抑制剂包括核酸抑制剂、蛋白抑制剂。其中核酸抑制剂选自：以IPO7或其转录本为靶序列、且能够抑制IPO7基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA（小发夹RNA）、小干扰RNA（siRNA）、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。蛋白抑制剂选自与IPO7蛋白特异性结合的物质，如能够抑制IPO7蛋白活性的抗体或配体。

在本发明的实施方案中，所述抑制剂选自核酸抑制剂。

在本发明的具体实施方案中，核酸抑制剂选自shRNA（小发夹RNA）和小干扰RNA（siRNA）。

本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。

本发明的药物还可与其他治疗结直肠癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分（例如，IPO7的抑制剂）同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分（如IPO7的抑制剂）的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。

本发明的药物组合物还包括药学上可接受的载体。

药学上可接受的载体包括但不限于稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

其中，稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇（粒状或粉状）、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖。

本发明提供了一种诊断结直肠癌/诊断结直肠癌转移/预测结直肠癌预后的系统/装置，所述系统/装置包括：

获取单元：用于获取样本中IPO7的表达水平；

处理单元：根据IPO7的表达情况，获得结直肠癌的诊断/诊断转移/预后预测结果。

与正常样本相比，若所述IPO7的表达水平呈现显著性上调，则诊断结果为结直肠癌；

与结直肠癌原发灶相比，若IPO7的表达水平呈现显著性上调，则诊断结果为结直肠癌肝转移；

IPO7的蛋白表达水平高的表示结直肠癌的预后不良。

下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。

实施例1 IPO7在结直肠癌中的表达情况

1.1实验材料

蛋白质组学所用组织标本信息：收集2019年10月~2020年7月期间于北京大学人民医院胃肠外科手术切除的未接受术前新辅助放化疗且合并同时性肝转移的结直肠癌患者的配对癌旁正常组织（距肿瘤边缘距离10cm以上）、结直肠癌原发灶以及肝转移灶（3例患者均因合并出血、梗阻等明显临床症状，且原发灶及肝转移灶均可切除而采取右半结肠切除术+肝部分切除术，未接受术前新辅助治疗）。所有获取的组织标本分为两份，一份在离体后30分钟内置于液氮中速冻，后保存于-80℃超低温冰箱中；另一部分于4%组织细胞固定液中固定，后进行石蜡包埋。最终蛋白质组学研究共纳入3例结直肠癌患者组织标本，其详细临床病理资料见表1。提取相应组织中的蛋白质，经质控合格后行TMT标记定量蛋白组学研究。

组织芯片：选取2019年1月~2021年1月在北京大学人民医院胃肠外科行同时性结直肠癌切除和肝切除患者的结直肠癌组织、肝转移灶组织和癌旁正常组织石蜡标本10例，所有患者术前均未接受放化疗。

结直肠癌以及配对癌旁正常组织大队列石蜡标本：收集于北京大学人民医院胃肠外科2014年12月~2016年12月期间手术切除的结直肠癌标本，纳入标准为病理诊断为结直肠癌；术前未接受新辅助放化疗以及靶向治疗；包含完整的临床病理资料（包括性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型、分化程度、脉管癌栓、TNM分期、AJCC分期等）以及随访信息（生存时间以及生存状态）。诊断结直肠癌时同时合并有其他肿瘤的患者排除在外。共纳入结直肠癌及其配对癌旁正常组织标本128对。所有标本制成组织芯片保存于北京大学人民医院外科肿瘤研究室。

1.2实验方法

1.2.1蛋白质组学分析

样本经标准化处理，由杭州景杰生物科技有限公司完成组学分析工作。

1.2.2免疫组化染色

（1）脱蜡和水化：石蜡切片60~70℃烘烤2小时，置于新鲜二甲苯中，浸泡10分钟×3次；去除多余的液体后，置于无水乙醇中，浸泡3分钟×3次；去除多余的液体后，置于95%乙醇中，浸泡3分钟×2次；去除多余的液体后，置于75%乙醇中，浸泡3分钟×2次；蒸馏水冲洗1分钟，置于PBS缓冲液中；

（2）抗原修复：抗原修复液（1×）使用前预热到95~100℃，将切片浸泡在抗原修复液中，95℃加热15分钟，随后大约在20~30分钟内冷却至室温，用PBS缓冲液洗涤1~2次，每次3~5分钟；

（3）阻断内源性过氧化物酶：根据组织大小，加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂（覆盖到全部组织），室温孵育10分钟，PBS缓冲液冲洗3分钟×3次；

（4）滴加一抗：根据一抗说明书按适当比例用抗体稀释液稀释一抗，按照组织大小滴加适量的一抗，4℃过夜；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次；

（5）滴加反应增强液：滴加适量的反应增强液（覆盖到组织即可），室温孵育20分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次；

（6）滴加增强酶标山羊抗兔IgG聚合物：滴加适量的增强酶标山羊抗兔IgG聚合物，室温孵育20分钟；PBS缓冲液冲洗3分钟×3次；

（7）配制DAB显色液：在1ml试剂2（DAB底物液）中，加入1滴（约50微升）试剂1（DAB浓缩液），混合均匀，即配成DAB工作液；

（8）复染：自来水冲洗，苏木素染色液孵育20秒，自来水冲洗洗去浮色，0.5%盐酸乙醇分化、自来水冲洗反蓝；

（9）脱水透明：置于75%乙醇中，浸泡3分钟×2次；去除多余液体后，置于95%乙醇中，浸泡3分钟×2次；去除多余液体后，置于无水乙醇中，浸泡3分钟×3次；去除多余液体后，置于新鲜二甲苯中，浸泡10分钟×3次；

（10）封片：滴加中性树胶后盖上盖玻片封片；

（11）结果判读：观察组织染色比例和强度，由两位经验丰富的病理科医师协助并进行双盲阅片，实验结果判读采用半定量评分标准评估：根据相对应指标的阳性染色细胞比例（<10%判定为0分，10%-40%判定为1分，40%-70%判定为2分，＞70%判定为3分）和相对应的指标阳性染色强度（0分表示不着色：1分表示着色为黄色：2分表示着色为棕黄色：3分表示着色为黄褐色），两者评分相加得染色指数，其中0-3表示弱表达，4-6表示强表达。

2.2.2统计学分析

使用SPSS22.0和GraphPad Prism 8进行统计学分析和作图。经方差齐性检验符合正态分布后采用独立样本t检验进行组间差异比较。

1.3实验结果

蛋白组学结果显示，在结直肠癌原发灶与癌旁正常组织样本中，有171个蛋白表达发生了明显上调，100个蛋白表达明显下调；在结直肠癌肝转移组织与原发灶中，有92个蛋白发生了明显上调，99个蛋白表达发生了明显下调（图1）。

将蛋白质组学结果中结直肠癌原发灶vs.正常组织差异表达蛋白筛选为肿瘤相关蛋白，进一步分析这些肿瘤相关蛋白在结直肠癌肝转移灶中的表达。通过对两组差异表达蛋白绘制韦恩图发现，在两组差异表达蛋白中，有1个共同上调蛋白（IPO7），该蛋白可能是影响结直肠癌发生肝转移的关键肿瘤相关蛋白（图2）。

在10例配对结直肠癌原发灶、肝转移灶以及正常结直肠上皮组织中，IPO7在结直肠癌原发灶和肝转移灶中的表达要高于正常组织，且肝转移组织中的表达高于肿瘤组织，与前期蛋白质组学结果一致（图3）。

128例结直肠癌患者配对结直肠癌及癌旁正常组织的石蜡标本中IPO7在结直肠癌患者肿瘤组织中的表达明显高于正常组织（p<0.001），进一步验证了前期实验结果（图4）。

实施例2 IPO7在结直肠癌预后预测中的应用

2.1实验材料

病人及组织：同实施例1，1.1实验材料中结直肠癌以及配对癌旁正常组织大队列石蜡标本。

2.2实验方法

2.2.1统计学分析

采用Kaplan-Meier法绘制结直肠癌患者生存曲线，通过对数秩检验（log-ranktest）进行显著性检验，采用卡方检验分析蛋白表达结直肠癌患者临床病理指标的关系，P<0.05为差异具有统计学意义。

2.3实验结果

IPO7的表达与结直肠癌患者淋巴结转移、远处转移以及肿瘤分期具有明显相关性（表2，p<0.01）。同时生存分析显示，高表达IPO7的结直肠癌患者总体生存率显著低于低表达患者（图5，p<0.05）

实施例3 IPO7在结直肠癌治疗中的应用

3.1实验材料

细胞系：人结肠癌细胞系DLD1、人胚肾细胞HEK293T均购自国家实验细胞资源共享服务平台。

3.2实验方法

3.2.1 siRNA转染

（1）针对IPO7的序列设计小干扰RNA，序列如表3所示；

（2）收到siRNA干粉后置于-20℃冰箱保存，使用前5000rpm离心5分钟，使管壁上的RNA粉末离心至管底，在超净工作台内小心打开，加入适量无酶水将其配成10μM溶液，分装保存；

（3）转染前一天将待转染的细胞接种于6孔板中，密度以次日转染时细胞融合率为50%为准；

（4）于超净工作台内配制转染混合液，每组siRNA准备两支无菌无酶离心管（A管和B管），于A管内加入5μl siRNA和200μl Opti-MEM，于B管中加入9μl RNAiMAX和200μl Opti-MEM，随后将B管内液体缓慢加入至A管中，轻轻混匀，室温静置10~15分钟；

（5）6孔板内更换新鲜培养基，将转染混合液缓慢加入，摇匀后置于培养箱中继续培养，24小时后更换新鲜培养基，48~72小时后进行后续实验。

3.2.2慢病毒包装及转染

（1）将HEK293T细胞接种于10cm细胞培养皿中，密度以第二天细胞融合度在70%~80%为准；

（2）于超净工作台内配制转染混合液，每个待转染质粒准备两支无菌无酶离心管（A管和B管），于A管内加入2.5μg shRNA质粒和5.0μl Lenti-Pac-HIV混合物，加入200μlOpti-MEM混匀，于B管中加入15μl Endofetin和200μl OptiMEM，随后将B管内液体缓慢加入至A管中，轻轻混匀，室温静置10~15分钟；

（3）细胞更换新鲜培养基，将转染混合液加入至对应的细胞中继续培养，8小时后更换新鲜培养基；

（4）转染48小时后，将含有病毒的培养基收集在15ml离心管中，4℃ 2000g离心10分钟，离心后，通过0.45μm滤器过滤上清液以去除细胞碎片；

（5）按照慢病毒液：浓缩试剂=5:1的体积混合慢病毒上清液和浓缩试剂，4℃孵育过夜；

（6）4℃ 3500g离心病毒液25分钟，离心后弃去上清液，向沉淀中加入1mlDMEM培养基重新悬浮慢病毒沉淀，将慢病毒液分装后保存于-80℃保存；

（7）慢病毒转染细胞前，将细胞铺于6cm培养皿中，密度以第二天病毒转染时融合度在70%~80%为准；

（8）感染当天，更换新鲜培养基，向培养液中加入适量病毒液，并按照1/1000的比例加入Polybrene，继续培养24小时后更换新鲜培养基继续培养；

（9）感染48~72小时后观察感染细胞荧光表达强度，使用合适浓度的嘌呤霉素筛选细胞，得到稳定转染的细胞株。

3.2.3细胞增殖实验

（1）将实验组和对照组细胞消化后调整细胞密度至10

（2）实验组和对照组细胞每组设6个重复孔，分别在96孔细胞培养板中每孔加入100μl单细胞悬液，注意每次吸取单细胞悬液前须将细胞混匀，在细胞周围空白孔中加入等量的PBS缓冲液减少培养基蒸发对实验结果的影响，连续加5个96孔板，将所有96孔板置于细胞培养箱中继续培养；

（3）在铺板8~10小时细胞贴壁后，将培养孔中的培养基更换为新鲜培养基，每孔中加入10μl CCK8试剂，为减少不同孔之间的误差，可以预先将CCK8试剂与培养基按1:9的比例混匀后在培养孔中每孔加入100μl，将加入CCK8试剂的培养板摇匀后继续放回培养箱孵育；

（4）2小时后取出培养板，使用酶标仪检测培养孔在450nm波长的吸光度；

（5）于第一次检测的24小时、48小时、72小时、96小时后重复上述操作，获得不同时间点的实验组和对照组细胞的吸光度。

3.2.4克隆形成实验

（1）将实验组和对照组细胞消化后调整细胞密度至10

（2）每3天更换新鲜培养基，将细胞连续培养8~10天后观察细胞，当每个细胞集落细胞数在80~100个时结束培养；

（3）弃去培养基，使用室温PBS小心清洗细胞1~2次，每孔加入2ml 4%组织细胞固定液将细胞固定15分钟；

（4）弃去固定液，使用PBS小心清洗1~2次后每孔加入2ml结晶紫染色15分钟，使用超纯水缓慢洗去结晶紫染液，待培养板风干后拍照，使用ImageJ对结果进行分析。

3.2.5划痕修复实验

（1）使用Ibidi公司生产的伤口愈合插件进行划痕修复试验，实验前将实验所需的伤口愈合插件、镊子置于紫外光下消毒1~2小时备用；

（2）将伤口愈合插件置于12孔板中，每孔一个，放置好后检查插件与培养板的粘附程度，避免在细胞培养过程中插件发生松动；

（3）将实验组和对照组细胞消化、离心，调整细胞密度至3~5×10

（4）待细胞完全贴壁后移去插件，使用PBS小心洗去未贴壁的细胞，于倒置显微镜下观察并拍照记录，结果记为0小时；

（5）使用含3%胎牛血清的培养基继续培养细胞，于24小时、48小时后观察划痕愈合情况并拍照记录；

（6）使用ImageJ对结果进行分析，计算伤口愈合率，伤口愈合率=（24小时或48小时空白区域面积-0小时区域部分面积）/0小时空白区域面积。

3.2.6 Transwell实验

Transwell实验分为迁移实验和侵袭实验。

迁移实验：

（1）水化基底膜：在每个小室中加入70μl RPMI1640无血清培养基，置于细胞培养箱中37℃孵育30分钟后小心吸去残余培养基；

（2）铺板：将实验组和对照组细胞消化，使用无血清RPMI 1640培养基调整细胞密度至5×10

（3）细胞固定及染色：培养适当时间后取出小室，使用常温PBS清洗1~2次，将小室置于4%组织细胞固定液中固定15分钟后再次使用PBS清洗1~2次洗去残余固定液，将小室置于结晶紫染液中染色15分钟，染色结束后使用PBS洗去残余结晶紫，使用棉签小心擦拭基底膜上层，将未发生迁移的细胞擦去；

（4）记录：待小室内液体晾干后，将小室置于显微镜下观察，随机选取3个视野拍照记录，使用ImageJ计数发生迁移的细胞个数。

侵袭实验：

（1）铺胶：实验前一天将Matrigel基质胶置于4℃冰箱融化，将实验需使用的枪头，离心管等置于-20℃冰箱预冷，实验前使用无血清RPMI 1640按照1：10的比例稀释基质胶，之后向每个小室上层中加入70μl基质胶，将培养板置于37℃培养箱中孵育5~6小时使基质胶凝固；

（2）侵袭实验其余操作同迁移实验。

3.2.7细胞周期检测

（1）收集细胞：消化、离心实验组和对照组细胞，收集10

（2）固定：再次加入1ml室温下的PBS重悬细胞，将细胞缓慢加入到3ml-20℃预冷的无水乙醇中，-20℃过夜；

（3）水化：将细胞离心弃去乙醇，加入5ml室温PBS，放置15分钟使细胞水化，离心弃上清；

（4）染色：加入1ml DNA染色试剂混匀，37℃避光孵育30分钟后在流式仪上进行检测。

3.2.8细胞凋亡检测

（1）消化、离心实验组和对照组细胞，计数后收集10

（2）每管加入5μl Annexin V-FITC和10μlPI，摇匀后室温避光孵育5分钟；

（3）细胞流式仪上通过FITC通道检测Annexin V-FITC和PI通道检测PI。

3.2.9统计学分析

应用GraphPad Prism 8和SPSS 22.0进行数据分析和作图，结果以mean±SD表示实验数据，使用独立样本t检验比较两组间差异，P<0.05为差异具有统计学意义。

3.3实验结果

4种不同的siRNA（siRNA-1，siRNA-2，siRNA-3，siRNA-4）均可以明显下调IPO7mRNA的表达，其中siRNA-1和siRNA-2敲低效果最明显；选取siRNA-1和siRNA-2的序列构建shRNA，进一步包装慢病毒转DLD1细胞构建敲低IPO7的稳转细胞株；待通过嘌呤霉素筛选获得表达绿色荧光的稳转细胞株后，重新检测稳转细胞株中IPO7在mRNA水平和蛋白水平的敲低效率，结果显示两种不同的干扰序列均能够明显下调IPO7的表达，证明敲低IPO7的稳转细胞株构建成功，可用于下一步的实验（图6）。

克隆形成实验结果显示，与对照组细胞相比，下调IPO7的表达后，DLD1细胞的增殖能力受到明显抑制（图7，p<0.05）。同时，克隆形成实验结果表明，抑制IPO7的表达明显降低了DLD1细胞的克隆形成能力（细胞克隆数目：shNC：121.7±13.43；shIPO7-1:87.67±11.02；shIPO7-2：89.67±13.32；shIPO7-1vs.shNC，P<0.05；shIPO7-2vs.shNC，p<0.05；图8）。

划痕修复实验显示，敲低IPO7组的伤口愈合率显著低于对照组（24小时伤口愈合率：shNC：17.4%±0.9045%；shIPO7-1:11.48%±1.809%；shIPO7-2:9.422%±3.104%；shIPO7-1 vs. shNC，P<0.01；shIPO7-2 vs. shNC，p<0.01；48小时伤口愈合率：shNC：41.1%±3.993%；shIPO7-1:31.78%±1.820%；shIPO7-2:17.80%±5.573%；shIPO7-1 vs. shNC，P<0.05；shIPO7-2 vs. shNC，p<0.01；图9）。

迁移实验结果表明，干扰IPO7表达后明显抑制了DLD1细胞的迁移能力（到达小室下层表面的细胞数：shNC：452.3±22.01；shIPO7-1:157.0±1.73；shIPO7-2: 161.7±10.50；shIPO7-1vs.shNC，P<0.01；shIPO7-2 vs. shNC，p<0.05；图10A，10B）；侵袭实验结果表明干扰IPO7表达明显降低了DLD1细胞的侵袭能力（到达小室下层表面的细胞数：shNC：490.0±25.24；shIPO7-1:206.7±4.04；shIPO7-2:197.7±24.50；shIPO7-1 vs. shNC，P<0.01；shIPO7-2 vs. shNC，p<0.01；图10C，10D）。

细胞周期检测结果显示，下调IPO7表达后，结肠癌细胞S期细胞数量明显增加（shNC：31.16%±0.6929%；shIPO7-1:38.9%±0.9100%；shIPO7-2:38.64%±0.6710%；shIPO7-1 vs. shNC，P<0.001；shIPO7-2 vs. shNC，p<0.001），而G1期细胞数量明显减少（G1期细胞百分比：shNC：46.99%±1.313%；shIPO7-1:39.77%±0.7373%；shIPO7-2:40.21%±1.123%；shIPO7-1 vs. shNC，P<0.01；shIPO7-2 vs. shNC，p<0.01），G2期细胞数量无明显影响（G2期细胞百分比：shNC：21.85%±0.7508%；shIPO7-1：21.33%±1.641%；shIPO7-2:21.15%±0.5268%；shIPO7-1 vs. shNC，P>0.05；shIPO7-2vs. shNC，p>0.05），可见干扰IPO7后可引起结肠癌细胞S期阻滞，影响细胞的分裂（图11）。

细胞凋亡检测结果显示，IPO7敲低组和对照组在早期凋亡方面存在明显差异（早期凋亡细胞百分比：shNC：3.687%±0.4283%；shIPO7-1:6.380%±0.2443%；shIPO7-2:5.117%±0.1387%，P<0.01；shIPO7-1 vs. shNC，P<0.001；shIPO7-2 vs. shNC，p<0.01）在晚期凋亡方面，虽然干扰组和对照组无明显差异（晚期凋亡细胞百分比：shNC：4.820%±1.093%；shIPO7-1:6.570%±0.1350%；shIPO7-2:6.003%±0.3781%，shIPO7-1 vs. shNC，P>0.05；shIPO7-2 vs. shNC，p>0.05），但仍显示除升高的趋势。这些结果表明干扰IPO7后，能够显著促进结直肠癌的凋亡，可见IPO7可能通过抑制肿瘤细胞的凋亡促进肿瘤细胞生存（图12）。

实施例4 IPO7与结直肠癌免疫细胞浸润关系

4.1实验材料

兔抗IPO7单克隆抗体，Abcam；兔抗CD68多克隆抗体，CST；兔抗CD163多克隆抗体，CST；兔HLA-DR多克隆抗体，CST；多标记免疫组化试剂盒，北京佰诺生物技术公司。

4.2实验方法

4.2.1组织芯片免疫组化

同实施例1中1.2实验方法的1.2.2免疫组化染色。

4.2.2石蜡切片多靶点免疫荧光

（1）多靶点免疫荧光染色选用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗对不同荧光染料进行活化，借助于不同的荧光染料标记，通过多轮染色循环实现多靶点染色；

（2）在一抗孵育结束后使用洗涤液浸洗玻片3次，每次5分钟，去除玻片上残存的液体，滴加HRP二抗工作液，浸没样本区域，室温孵育15分钟；

（3）使用洗涤液浸洗玻片3次，每次5分钟，去除残存液体后在玻片上滴加1×染料工作液100μl，浸没样本区域，室温孵育15分钟；

（4）使用洗涤液浸洗玻片3次，每次5分钟，洗涤结束后微波修复，室温自然冷却至室温，使用洗涤液浸洗玻片3次，每次5分钟；

（5）按照上述步骤进行下一个靶标的染色；

（6）使用DAPI复染细胞核，避光室温孵育15分钟；

（9）封片：使用抗荧光淬灭封片剂封片，于荧光显微镜下观察并采集图像。

4.2.3统计学分析

下载TIMER数据库中不同肿瘤浸润免疫细胞的丰度数据，包括B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞，评估结直肠癌中IPO7表达与六种类型的免疫细胞浸润之间的相关性。

应用软件GraphPad Prism 8和SPSS 22.0进行数据分析和作图，使用t检验比较两组间差异，采用卡方检验分析石蜡标本中IPO7表达与巨噬细胞浸润的关系，P<0.05为差异具有统计学意义。

4.3实验结果

结果表明不论在结肠癌或直肠癌中IPO7的表达均与巨噬细胞浸润之间具有较强的相关性（表4）

在结直肠癌中IPO7表达与巨噬细胞浸润呈正相关关系，高表达IPO7的结直肠癌组织中M1型巨噬细胞浸润下调而M2型巨噬细胞浸润上调，低表达IPO7的结直肠癌组织中M2型巨噬细胞浸润下调而M1型巨噬细胞浸润上调（图13）。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。