一种用于癫痫患者无创诊断的血清代谢物标志物及其应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于癫痫患者无创诊断的血清代谢物标志物及其应用。本发明提供了一种用于区别癫痫患者和健康人群的血清代谢物标志物(血清代谢物模型)，该血清代谢物组合由L‑alpha‑glutamyl‑L‑hydroxyproline、Vulgarone A、MG(0:0/14:1(9Z)/0:0)、Cis‑3‑Hexenyl phenylacetate组成，所述代谢物在人体血清中富集。本发明的代谢物区别模型在癫痫患者和健康对照者中实现了良好的区别能力。

说明书

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于癫痫患者无创诊断的血清代谢物标志物及其应用。

背景技术

癫痫是一种影响各个年龄人群的慢性非传染性疾病，全球每年大约有500万人被诊断为该神经系统疾病(WHO)。它的特征是具有产生癫痫发作的持久倾向，以及因此带来的神经生物学、认知、心理和社会后果。至此，癫痫没有容易获得的金标准，完整的病史和目击者的可靠叙述是诊断的关键。此外，癫痫的多态性以及各种因素也使得诊断更加复杂，从第一次未被识别的癫痫发作到出现癫痫发作的时间包含几周到几十年不等。不幸的是，癫痫的延迟就诊和误诊并不少见，并且具有潜在的破坏性。因此，找到一种全面、可靠的筛查或诊断方法就显的十分重要。

代谢物是局部或全身细胞反应的结果，同时由于它可以穿过血脑屏障，因此可以代表中枢神经系统的生物现象的改变。Edward Beamer等人发现嘌呤腺苷及其分解产物的血液水平可以作为癫痫和癫痫发作的生物标志物。Udo Fh Engelke等人将代谢组学和红外离子光谱相结合，发现6-oxoPIP可作为诊断吡哆醇依赖性癫痫(PDE-ALDH7A1)的生物标志物。然而，大样本癫痫患者的代谢组学未被表征和研究。

基于以往的代谢组学的研究结果，我们试图通过大样本的血清代谢组学来进一步发现癫痫患者在微生态和代谢物方面的改变，并构建相关的生物标志物，为癫痫的早期诊断和发病机制提供广阔的理论基础。

发明内容

本发明提供了一种用于区别癫痫患者和健康人群的血清代谢物标志物(血清代谢物模型)，该血清代谢物组合由L-alpha-glutamyl-L-hydroxyproline、Vulgarone A、MG(0:0/14:1(9Z)/0:0)、Cis-3-Hexenyl phenylacetate组成，所述代谢物在人体血清中富集。

所述血清代谢物标志物在制备癫痫与健康人群的区分检测试剂盒中的应用。

所述癫痫与健康人群的区分检测试剂盒适用于区别癫痫患者和健康人群。

所述血清代谢物标志物的检测方法为：对所述对象的血清进行检测，以便确定该样本是否包含所述的代谢物，是否可以建立区别癫痫患者和健康人群的代谢物模型。

通过收集入组对象的血清样本，得到血清提取物，完成非靶向代谢物组学，检测是否存在权利要求1所述的4种代谢物。

进一步的，通过收集入组对象的血清样本得到血清提取物，通过液相色谱质谱联用检测受试者的血清样本中所述血清代谢物组合的浓度水平；基于代谢物检测数据，在训练集中建立癫痫患者与健康人群的代谢物区别模型，建立癫痫患病率(probability ofdisease，POD)指数；POD指数在验证集中计算其区别能力，进行验证。

具体包括：

(1)收集入组对象的血清样本，入组对象包括100例癫痫患者和200例健康对照，用血清样本提取液处理来自受试者的血清样本，得到血清提取物，通过非靶向代谢组学技术检测血清代谢物浓度；

(2)基于非靶向代谢组学数据，在代谢物区别模型的训练集中，在100例癫痫患者和200例健康对照者之间，基于一个随机森林模型，通过一个五倍交叉验证的算法，鉴定了用于该模型的最佳的4个代谢物标志物；

(3)基于4个代谢物标志物，通过使用随机生成的决策树的比率来计算癫痫的患病率(Probability of disease,POD)指数；

(4)该代谢物区别模型在100例癫痫患者和200例健康对照者之间的区别能力达到99.4％，POD指数在癫痫患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)；

(5)在验证集中，该微生物区别模型在57例癫痫患者和101例健康对照之间的区别能力达到100％；POD指数在癫痫患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)。

因此，本发明的血清代谢物区别模型在癫痫患者和健康对照人群中实现了良好的区别能力。

另外，还提供了一种用于区别癫痫患者和健康人群的血清代谢物模型的试剂盒。

本发明的具体操作步骤如下：

(1)按照前瞻性临床试验的设计原则，本发明的研究设计如图1所示。

(2)将使用普通血清管收集的每例全血在4℃下以10000rpm离心10分钟后收集上清液(200μL)，并储存在-80℃。

(3)去除上清液内蛋白沉淀及杂质后，在超高效液相色谱-质谱联UPLC-MS的正、负模式下分别上机检测采集信息，得到代谢物的MS和MS/MS信息。质量控制样品由随机挑选的20个样品的10μL上清液混合而成，用以评价UPLC-MS分析过程的重复性和稳定性。

(4)采用Progenesis QI(Waters Corporation，Milford,USA)软件进行数据预处理，并结合自建数据库、HMDB(http://www.hmdb.ca/)和Metlin(https://metlin.scripps.edu/)等数据库对代谢物注释，得到代谢物列表及数据矩阵。最终，结合T检验和VIP(由OPLS-DA得到)筛选出差异代谢物，进一步采用通路分析、关联分析、聚类分析等高级分析对差异代谢物的生物学信息进行可视化。

(5)在代谢物区别模型的训练集中，包括100例癫痫患者和200例健康对照。在一个随机森林模型(R软件3.4.1和随机森林软件包4.6–12)中采用五倍交叉验证的算法(除了设置“importance＝TRUE”之外，软件参数默认)进行代谢物标志物的筛选。采用五倍交叉验证的5次试验，获得了交叉验证错误曲线，其中最小的交叉验证错误点作为cut-off值使用。最小的交叉验证错误值加上对应值的标准差为cut-off值。筛选出小于cut-off值的错误率的OTUs标志物的集合，选择最小数目代谢物的集合作为最佳的代谢物标志物的集合，最终鉴定了用于该模型的最佳的4个代谢物标志物(图2)。

(6)通过使用随机生成的决策树的比率来计算患病率(Probability of disease,POD)指数。决策树预测样本为“E”，设置的参数预测为：proximity＝T,norm.votes＝T,predict.all＝TRUE。在LOO模式中构建的随机森林模型用于预测验证集中每一个样本的POD指数，最终计算每一个样本的平均预测的POD指数。

(7)使用R 3.3.0程序包中的pROC工具计算受试者工作曲线(ROC)，用来评估代谢物区别模型，曲线下面积(AUC)用于指定ROC的效应值。

(8)该微生物区别模型在100例癫痫患者和200例健康对照之间的区别能力达到99.4％(图4)，POD指数在癫痫患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)(图3)。

(10)在验证集中，POD指数在癫痫患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)(图5)，该微生物区别模型在31例癫痫患者和82例健康对照之间的区别能力达到100％(图6)。

因此，本发明的代谢物区别模型在癫痫患者和健康对照者中实现了良好的区别能力。

附图说明

图1.一种用于区别癫痫和健康人群的血清代谢物模型的研究设计和临床应用；

图2.基于随机森林模型采用五倍交叉验证法鉴定的最佳的血清代谢物标志物；

图3.在100例癫痫患者和200例健康对照的训练集中，患病率(POD)指数在两组之间的表达差异；

图4.在100例癫痫患者和200例健康对照的训练集中，代谢物区别模型实现的区别效能；

图5.在验证集中，与82例健康对照人群相比，患病率(POD)指数在31例癫痫患者的表达差异；

图6.在验证集中，患病率(POD)指数在82例健康对照和31例癫痫患者之间的区别能力。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明的保护内容不仅限于这些实施例。

下列实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。下列实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为公开商业途径获得。

本发明通过收集入组对象的血清代谢物样本，用血清样本提取液处理来自受试者的血清样本，得到血清提取物，通过非靶向代谢组学技术检测血清代谢物浓度。基于非靶向代谢组学数据，在训练集中建立癫痫患者和健康人群的代谢物区别模型，建立癫痫患病率(probability of disease，POD)指数；POD指数在验证集中计算其区别能力，进行验证。

其操作步骤如下：

(1)按照前瞻性临床试验的设计原则，本发明的研究设计如图1所示。该研究方案得到了郑州大学第一附属医院伦理委员会的批准。所有入组的患者签署研究方案知情同意书和临床样本收集知情同意书。

(2)将使用普通血清管收集的每例全血在4℃下以10000rpm离心10分钟后收集上清液(200μL)，并储存在-80℃。

(3)去除上清液内蛋白沉淀及杂质后，在超高效液相色谱-质谱联UPLC-MS的正、负模式下分别上机检测采集信息，得到代谢物的MS和MS/MS信息。质量控制样品由随机挑选的20个样品的10μL上清液混合而成，用以评价UPLC-MS分析过程的重复性和稳定性。

(4)采用Progenesis QI(Waters Corporation，Milford,USA)软件进行数据预处理，并结合自建数据库、HMDB(http://www.hmdb.ca/)和Metlin(https://metlin.scripps.edu/)等数据库对代谢物注释，得到代谢物列表及数据矩阵。最终，结合T检验和VIP(由OPLS-DA得到)筛选出差异代谢物，进一步采用通路分析、关联分析、聚类分析等高级分析对差异代谢物的生物学信息进行可视化。

(5)在代谢物区别模型的训练集中，包括100例癫痫患者和200例健康对照。在一个随机森林模型(R软件3.4.1和随机森林软件包4.6–12)中采用五倍交叉验证的算法(除了设置“importance＝TRUE”之外，软件参数默认)进行代谢物标志物的筛选。采用五倍交叉验证的5次试验，获得了交叉验证错误曲线，其中最小的交叉验证错误点作为cut-off值使用。最小的交叉验证错误值加上对应值的标准差为cut-off值。筛选出小于cut-off值的错误率的代谢物标志物的集合，选择最小数目代谢物的集合作为最佳的代谢物标志物的集合，最终鉴定了用于该模型的最佳的4个代谢物标志物(图2)。

(6)通过使用随机生成的决策树的比率来计算患病率(Probability of disease,POD)指数。决策树预测样本为“E”，设置的参数预测为：proximity＝T,norm.votes＝T,predict.all＝TRUE。在LOO模式中构建的随机森林模型用于预测验证集中每一个样本的POD指数，最终计算每一个样本的平均预测的POD指数。

(7)使用R 3.3.0程序包中的pROC工具计算受试者工作曲线(ROC)，用来评估微生物区别模型，曲线下面积(AUC)用于指定ROC的效应值。

(8)该代谢物区别模型在100例癫痫患者和200例健康对照之间的区别能力达到99.4％(图4)，POD指数在癫痫患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)(图3)。

(10)在验证集中，POD指数在癫痫患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)(图5)，该代谢物区别模型在31例癫痫患者和82例健康对照之间的区别能力达到100％(图6)。

因此，本发明的血清代谢物区别模型在癫痫患者和健康人群中实现了良好的区别能力。