一种用于癫痫发作控制患者无创诊断的口腔微生物基因标志物及其应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于癫痫发作控制患者无创诊断的口腔微生物基因标志物及其应用。本发明提供了一种用于区别癫痫发作控制患者和健康人群的口腔微生物基因标志物(口腔微生物模型)，由SEQ ID NO:1‑3所示的3种微生物基因组成，所述微生物基因在人体口腔中富集。本发明的微生物基因区别模型在癫痫发作控制患者和健康对照者中实现了良好的区别能力。

说明书

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于癫痫发作控制患者无创诊断的口腔微生物基因标志物及其应用。

背景技术

癫痫是一种影响各个年龄人群的慢性非传染性疾病，全球每年大约有500万人被诊断为该神经系统疾病(WHO)。它的特征是具有产生癫痫发作的持久倾向，以及因此带来的神经生物学、认知、心理和社会后果。癫痫的多态性以及各种因素也使得诊断更加复杂，从第一次未被识别的癫痫发作到出现癫痫发作的时间包含几周到几十年不等。不幸的是，癫痫的延迟就诊和误诊并不少见，并且具有潜在的破坏性。

肠道微生物和大脑通过激活迷走神经、调节内分泌和免疫反应以及产生微生物代谢物等方式相互交流。当基因多态性、环境刺激、饮食变化和胃肠道紊乱等变化影响到脑-肠轴时，就会出现神经和精神疾病的发展。例如，Christine A等人的动物实验清楚地表明特定的肠道菌群介导了生酮饮食的抗癫痫作用，并与全身γ-谷氨酸化氨基酸的减少和海马GABA/谷氨酸水平升高相关。同时，多项人体研究表明相比健康人，难治性癫痫的肠道菌群组成发生了改变。而口腔菌群作为一个不断补充肠道菌群的微生物库，至少有三分之一的口腔微生物细胞通过消化道进入健康人的肠道。然而，癫痫发作控制患者的口腔菌群特征还不清楚。

近年来，随着测序技术的发展，人们对微生物组的组成、功能和代谢潜力与疾病的关系进行了广泛的研究。肠道微生物群对各种神经发育、神经精神和神经退行性疾病的诊断潜力已被令人瞩目的研究证实，但少有研究突出了癫痫发作控制患者和健康对照组的口腔微生物群之间的区别，口腔微生物群可能在癫痫康复发作中发挥了重要作用，因此可能成为药物治疗的新靶点或生物标志物，口腔微生物群对癫痫的诊断潜力有待进一步评估。

发明内容

本发明提供了一种用于区别癫痫发作控制患者和健康人群的口腔微生物基因标志物(口腔微生物模型)，由SEQ ID NO:1-3所示的3种微生物基因组成，所述微生物基因在人体口腔中富集。序列如下：

＞OTU34

CCTACGGggggCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTGTTAGCATCGAAGAAGCGAAAGTGACGGTAGGTGCAGAGAAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTTGTAGGCGGTTGGTCGCGTCTGCTGTGAAAGGCCGGGGCTTAACTCCGGTTTTGCAGTGGGTACGGGCTAACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCACAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGAAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTAGTAGTC

＞OTU 43

CCTACGGGTGGCAGCAGTAGGGAATATTGCTCAATGGgggAAACCCTGAAGCAGCAACGCCGCGTGGAGGATGACACTTTTCGGAGCGTAAACTCCTTTTGTTAGGGAAGAACAATGACGGTACCTAACGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATCACTGGGCGTAAAGGACGCGTAGGCGGATTATCAAGTCTCTTGTGAAATCCTATGGCTTAACCATAGAACTGCTTGGGAAACTGATAATCTAGAGTGAGGGAGAGGCAGATGGAATTGGTGGTGTAGGGGTAAAATCCGTAGAGATCACCAGGAATACCCATTGCGAAGGCGATCTGCTGGAACTCAACTGACGCTAATGCGTGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCGAGTAGTC

＞OTU 72

CCTACGGGTGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGCAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAACAGCGCATAGAGTAACTGTTATGCGTGTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGAGTGTAGGCGGTCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGCGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATatatGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTctctGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCCTGTAGTC

另外本发明还提供了一种用于检测试剂，包括用于检测SEQ ID NO:1-3所示的3种微生物基因的引物，所述引物序列为SEQ ID NO:4-5。

引物Primers

测序区域V3+V4：341F-805R

上游引物：341F CCTACGGGNGGCWGCAG

下游引物：805R GACTACHVGGGTATCTAATCC

本发明还提供了检测试剂在建立一种区别癫痫发作控制患者和健康人群的口腔微生物模型中的应用，所述检测试剂适用于检测SEQ ID NO:1-3所示的3种微生物基因。

所述微生物区别模型适用于区别癫痫发作控制患者和健康人群。

对所述对象的舌拭子进行检测，以便确定该样本是否包含所述的微生物基因，是否可以建立区别癫痫发作控制患者和健康人群的微生物基因模型。

通过收集入组对象的舌拭子样本，抽提微生物总DNA，完成微生物DNA的16S rDNAMiseq测序，检测是否存在权利要求1所述的3种微生物基因。

进一步的，通过收集入组对象的舌拭子样本，抽提微生物总DNA，进行口腔菌群的16SrDNA Miseq测序。基于高通量测序数据，在训练集中建立癫痫发作控制患者和健康人群的微生物区别模型，建立患病率(POD)指数。

具体包括：

(1)收集入组对象(癫痫发作控制患者和健康人群)的舌拭子样本，按照DNA的标准抽提方法完成舌拭子样本中微生物总DNA的抽提，在Illumina MiSeq平台完成口腔菌群的16SrDNA高通量测序工作；

(2)基于高通量测序数据，在微生物区别模型的训练集中，在22例癫痫发作控制患者和44例健康对照之间，基于一个随机森林模型，通过一个五倍交叉验证的算法，鉴定了用于该模型的最佳的3个微生物基因标志物。

(3)基于3个微生物基因标志物，通过使用随机生成的决策树的比率来计算患病率(POD)指数。

(4)该微生物区别模型在22例癫痫患者和44例健康对照之间的区别能力达到98.14％，POD指数在癫痫发作控制患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)。

因此，本发明的微生物基因区别模型在癫痫发作控制患者和健康对照人群中实现了良好的区别能力。

另外，还提供了一种用于区别癫痫发作控制患者和健康人群的口腔微生物模型的试剂盒，包括用于检测权利要求1所述的SEQ ID NO:1-3所示的3种微生物基因的引物。

本发明的具体操作步骤如下：

(1)按照前瞻性临床试验的设计原则，本发明的研究设计如图1所示。该研究方案得到了郑州大学第一附属医院伦理委员会的批准。所有入组的患者签署研究方案知情同意书和临床样本收集知情同意书。

(2)每一个入组的癫痫发作控制患者和健康人群提供一份舌拭子，并立即冻存于-80℃冰箱。舌拭子细菌总DNA的抽提方法按照试剂盒的说明书进行。

(3)完成口腔细菌总DNA样本的扩增和DNA文库构建，在IlluminaMiseq测序平台完成16S rDNA测序。所有的输出序列完成基本的预处理和基本的生物信息学分析。

(4)从所有样本中随机抽选等量的序列数，按照UPARSE传递途径拼接成对应的16SrDNA基因序列分类单元(Operational Taxonomy Units,OTUs)。按照微生物基因标志物训练集和微生物基因标志物验证集，将产生的所有样本的OTUs基因序列收集整理。基于微生物基因序列，使用RDP分类器2.6版本注释。

(5)基于高通量测序数据产生的代表性序列，计算出微生物基因标志物发现集的OTUs频率文件和验证集的OTUs频率文件。这些OTUs用于一个相关性研究来鉴定在癫痫发作控制患者和健康人群之间差异明显的OTUs丰度。使用Wilcoxon检验方法统计分析癫痫发作控制患者和健康人群之间差异的微生物基因标志物。选择出具有统计学差异的OTUs微生物基因标志物做进一步的分析。

(6)在微生物区别模型的训练集中，包括22例癫痫患者和44例健康对照，使用筛选出的OTUs丰度文件，在一个随机森林模型(R软件3.4.1和随机森林软件包4.6–12)中采用五倍交叉验证的算法(除了设置“importance＝TRUE”之外，软件参数默认)进行微生物基因标志物的筛选。采用五倍交叉验证的5次试验，获得了交叉验证错误曲线，其中最小的交叉验证错误点作为cut-off值使用。最小的交叉验证错误值加上对应值的标准差为cut-off值。筛选出小于cut-off值的错误率的OTUs标志物的集合，选择最小数目OTUs的集合作为最佳的微生物基因标志物的集合，最终鉴定了用于该模型的最佳的3个微生物基因标志物(图2)。选择出的3个微生物OTUs标志物的基因序列见SEQ ID NO:1-3。

(7)通过使用随机生成的决策树的比率来计算发作控制率指数。决策树预测样本为“E”，设置的参数预测为：proximity＝T,norm.votes＝T,predict.all＝TRUE。在LOO模式中构建的随机森林模型用于预测验证集中每一个样本的发作控制率指数，最终计算每一个样本的平均预测的发作控制率指数。

(8)使用R 3.3.0程序包中的pROC工具计算受试者工作曲线(ROC)，用来评估微生物区别模型，曲线下面积(AUC)用于指定ROC的效应值。

(9)该微生物区别模型在22例癫痫患者和44例健康对照之间的区别能力达到98.14％(图4)，POD指数在癫痫发作控制患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)(图3)。

因此，本发明的微生物基因区别模型在癫痫发作控制患者和健康对照者中实现了良好的区别能力。

附图说明

图1.一种用于区别癫痫发作控制患者和健康人群的口腔微生物模型的研究设计和临床应用；

图2.基于随机森林模型采用五倍交叉验证法鉴定的最佳的口腔微生物基因标志物；

图3.在22例癫痫患者和44例健康对照的训练集中，患病率(POD)指数在两组之间的表达差异；

图4.在22例癫痫患者和44例健康对照的训练集中，微生物基因区别模型实现的区别效能；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明的保护内容不仅限于这些实施例。

下列实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。下列实施例中所需要的材料或试剂，如无特殊说明均为公开商业途径获得。

本发明通过收集入组对象的舌拭子样本，抽提微生物总DNA，进行口腔菌群的16SrDNA Miseq测序。基于高通量测序数据，在训练集中建立癫痫发作控制患者和健康人群的微生物区别模型，建立患病率指数。

其操作步骤如下：

(1)按照前瞻性临床试验的设计原则，本发明的研究设计如图1所示。该研究方案得到了郑州大学第一附属医院伦理委员会的批准。所有入组的患者签署研究方案知情同意书和临床样本收集知情同意书。

(2)每一个入组的癫痫患者和健康人群提供一份舌拭子样本，并将舌拭子放入无菌的冻存管中并立即存储到-80℃的冰箱中。粪便细菌总DNA的抽提方法按照试剂盒的说明书进行。

(3)完成口腔细菌总DNA样本的扩增和DNA文库构建，在IlluminaMiseq测序平台完成16S rDNA测序。所有的输出序列完成基本的预处理和基本的生物信息学分析。

(4)从所有样本中随机抽选等量的序列数，按照UPARSE传递途径拼接成对应的16SrDNA基因序列分类单元(Operational Taxonomy Units,OTUs)。按照微生物基因标志物训练集和微生物基因标志物验证集，将产生的所有样本的OTUs基因序列收集整理。基于微生物基因序列，使用RDP分类器2.6版本注释。

(5)基于高通量测序数据产生的代表性序列，计算出微生物基因标志物发现集的OTUs频率文件和验证集的OTUs频率文件。这些OTUs用于一个相关性研究来鉴定在癫痫发作控制患者和健康人群之间差异明显的OTUs丰度。使用Wilcoxon检验方法统计分析癫痫发作控制患者和健康人群之间差异的微生物基因标志物。选择出的OTUs微生物基因标志物做进一步的分析。

(6)在微生物区别模型的训练集中，包括22例癫痫患者和44例健康对照，使用筛选出的OTUs丰度文件，在一个随机森林模型(R软件3.4.1和随机森林软件包4.6–12)中采用五倍交叉验证的算法(除了设置“importance＝TRUE”之外，软件参数默认)进行微生物基因标志物的筛选。采用五倍交叉验证的5次试验，获得了交叉验证错误曲线，其中最小的交叉验证错误点作为cut-off值使用。最小的交叉验证错误值加上对应值的标准差为cut-off值。筛选出小于cut-off值的错误率的OTUs标志物的集合，选择最小数目OTUs的集合作为最佳的微生物基因标志物的集合，最终鉴定了用于该模型的最佳的3个微生物基因标志物(图2)。选择出的3个微生物OTUs标志物的基因序列见SEQ ID NO:1-3。

(7)通过使用随机生成的决策树的比率来计算患病率(Probability of disease,POD)指数。决策树预测样本为“E”，设置的参数预测为：proximity＝T,norm.votes＝T,predict.all＝TRUE。在LOO模式中构建的随机森林模型用于预测验证集中每一个样本的POD指数，最终计算每一个样本的平均预测的POD指数。

(8)使用R 3.3.0程序包中的pROC工具计算受试者工作曲线(ROC)，用来评估微生物区别模型，曲线下面积(AUC)用于指定ROC的效应值。

(9)该微生物区别模型在22例癫痫患者和44例健康对照之间的区别能力达到98.14％(图4)，POD指数在癫痫发作控制患者中明显升高，两组之间有显著性差异(p＜0.0001)(图3)。

因此，本发明的微生物基因区别模型在癫痫发作控制患者和健康人群中实现了良好的区别能力。

序列表

<110> 郑州大学第一附属医院

<120> 一种用于癫痫发作控制患者无创诊断的口腔微生物基因标志物及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 445

<212> DNA

<213> 口腔微生物( oral microflora)

<400> 1

cctacggggg gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagcgacgc 60

cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta aacctctgtt agcatcgaag aagcgaaagt 120

gacggtaggt gcagagaaag cgccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 180

ggcgcgagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagagctt gtaggcggtt ggtcgcgtct 240

gctgtgaaag gccggggctt aactccggtt ttgcagtggg tacgggctaa ctagagtgca 300

gtaggggaga ctggaattcc tggtgtagcg gtggaatgca cagatatcag gaggaacacc 360

gatggcgaag gcaggtctct gggctgtaac tgacgctgag aagcgaaagc atggggagcg 420

aacaggatta gataccctag tagtc 445

<210> 2

<211> 441

<212> DNA

<213> 口腔微生物( oral microflora)

<400> 2

cctacgggtg gcagcagtag ggaatattgc tcaatggggg aaaccctgaa gcagcaacgc 60

cgcgtggagg atgacacttt tcggagcgta aactcctttt gttagggaag aacaatgacg 120

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<210> 3

<211> 465

<212> DNA

<213> 口腔微生物( oral microflora)

<400> 3

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cgcgtgagtg aagaaggtct tcggatcgta aagctctgtt gttagagaag aacagcgcat 120

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gtaggcggtc ttttaagtct gatgtgaaag cccacggctc aaccgtggag ggtcattgga 300

aactgggaga cttgagtgca gaagaggaga gcggaattcc atgtgtagcg gtgaaatgcg 360

tagatatatg gaggaacacc agtggcgaag gcggctctct ggtctgtaac tgacgctgag 420

gctcgaaagc gtggggagca aacaggatta gatacccctg tagtc 465

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctacgggng gcwgcag 17

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gactachvgg gtatctaatc c 21