依曲韦林在抗狂犬病病毒中的应用和抗狂犬病病毒药物的筛选方法

摘要

本发明提供了一种依曲韦林在抗狂犬病病毒中的应用和抗狂犬病病毒药物的筛选方法，涉及抗狂犬病病毒药物技术领域。本发明发现依曲韦林具有抗狂犬病病毒活性，确定了依曲韦林在抗狂犬病病毒中的作用。同时本发明提供了抗狂犬病病毒药物的筛选方法，通过使用荧光标记的狂犬病病毒感染细胞，使用候选药物处理感染病毒的细胞，再观察细胞的荧光强度，能够通过荧光显微镜以连续和非损害方式来分析和定量病毒的复制。

说明书

技术领域

本发明涉及抗狂犬病病毒药物技术领域，尤其是涉及一种依曲韦林在抗狂犬病病毒中的应用和抗狂犬病病毒药物的筛选方法。

背景技术

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起的一种高度致死性的人兽共患传染病，以侵害中枢神经系统为特征，引起人和其他哺乳动物的脑炎。到目前为止，狂犬病仍是一种无法治愈的疾病，唯一的预防方法是在暴露前或暴露后进行疫苗接种。一旦出现临床症状，病死率高达100％。因此，急需寻找更多的有效的抗RABV药物。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供依曲韦林在非诊断和治疗目的的抗狂犬病病毒中的应用，本发明发现依曲韦林具有抗狂犬病病毒活性，确定了依曲韦林在抗狂犬病病毒中的作用。

本发明的第二目的在于提供依曲韦林在制备用于预防和/或缓解细胞狂犬病病毒感染的药物，或制备用于治疗和/或预防狂犬病的药物中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种抗狂犬病病毒药物的筛选方法。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了依曲韦林在非诊断和治疗目的的抗狂犬病病毒中的应用。

优选地，所述狂犬病病毒包括狂犬病病毒株PV株、PM株、Flury株、 SAD株、aG株、CVS株或CTN株；优选为CVS株，更优选为CVS-11株。

优选地，所述应用包括：预防细胞感染狂犬病病毒；和/或抑制细胞中狂犬病病毒的生长和增殖。

优选地，所述细胞包括N2A细胞和BHK细胞。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了依曲韦林在制备用于预防和/ 或缓解细胞狂犬病病毒感染的药物中的应用。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了依曲韦林在制备用于治疗和/ 或预防狂犬病的药物中的应用。

根据本发明的一个方面，本发明还提供了抗狂犬病病毒药物的筛选方法，包括如下步骤：

(a)使用荧光标记的狂犬病病毒感染细胞；

(b)使用候选药物处理感染狂犬病病毒的细胞；

(c)观察细胞的荧光强度。

优选地，所述荧光标记的狂犬病病毒为荧光标记的CVS-11，优选为 EGFP标记的CVS-11重组病毒。

优选地，使用荧光标记的狂犬病病毒感染N2A细胞。

优选地，所述筛选方法包括如下步骤：

(a)使用EGFP标记的CVS-11重组狂犬病病毒感染N2A细胞；

(b)使用候选药物处理感染CVS-11重组狂犬病病毒的N2A细胞；

(c)观察N2A细胞中的荧光强度。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过实验发现依曲韦林具有抗RABV的活性，依曲韦林能够有效的抑制细胞中RABV的增殖，细胞感染RABV后，在培养基中含有依曲韦林的生长环境下，细胞中的RABV的生长和增殖能够得到有效的抑制，经荧光定量PCR检测和免疫印迹实验鉴定，RABV的P基因的mRNA和P 蛋白的表达量显著降低。因此可以将依曲韦林应用于非诊断和治疗目的的抗RABV领域中。

基于本发明发现的依曲韦林的抗RABV的活性，本发明提供的依曲韦林在制备用于预防和/或缓解细胞RABV感染的药物中的应用以及在制备用于治疗和/或预防狂犬病的药物中的应用，为抗RABV的药物的选择，和治疗狂犬病的候选药物提供了新的活性成分供进一步的研究。

本发明提供的抗RABV药物的筛选方法，能够在荧光显微镜下直接观察细胞中外源表达的荧光蛋白。此外，与携带荧光素酶报告基因的重组病毒相比，检测荧光信号时表达荧光蛋白的重组病毒不需要加入任何底物。所以，可以通过荧光显微镜以连续和非损害方式来分析和定量病毒的复制。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为N2A细胞感染CVS-11或CVS-11-EGFP后，分别于感染后0h、 12h、24h、48h、72h和96h收获细胞上清，检测病毒滴度得到的病毒生长曲线；

图2为N2A细胞分别感染CVS-11和CVS-11-EGFP后，分别于感染后 0h、12h、24h、48h、72h、96h细胞经蛋白裂解液裂解后经Western blotting，检测病毒P蛋白的表达结果；

图3为N2A细胞感染CVS-11-EGFP后，使用候选抗病毒化合物小分子处理感染细胞，于感染后48h进行病毒的检测，通过直接免疫荧光实验检测病毒增殖情况，图中分别为加入Etravirine、Abacavir、Delavirdine和 Nevirapine后，以及未加入药物和空白对照的荧光观察结果；

图4为N2A细胞感染CVS-11后，使用Etravirine、Abacavir、Delavirdine 和Nevirapine处理感染细胞后，CVS-11的P基因mRNA的表达量；

图5为N2A细胞感染CVS-11后，使用Etravirine、Abacavir、Delavirdine 和Nevirapine处理感染细胞后，细胞经蛋白裂解液裂解后经Western blotting 检测病毒P蛋白的表达结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了依曲韦林在非诊断和治疗目的的抗RABV中的应用。

依曲韦林(Etravirin)是一种非核苷类逆转录酶抑制剂，具有抗HIV感染作用。本发明通过实验发现依曲韦林具有抗RABV的活性，细胞感染 RABV后，在培养基中含有依曲韦林的生长环境下，细胞中的RABV的生长和增殖能够得到有效的抑制，经荧光定量PCR检测和免疫印迹实验鉴定， RABV的P基因的mRNA和P蛋白的表达量显著降低。

以非诊断和治疗为目的将依曲韦林应用于抗RABV的实例例如可以为但不限于为：以依曲韦林作为RABV的抑制剂，研究RABV对细胞或动物的生理生化过程的影响；以依曲韦林作为阳性对照，研究效果未知的药物对细胞或实验动物抗RABV的效果等。

本发明所述的抗RABV，包括本领域常规的RABV毒株，例如可以为但不限于为RABV株PV株、PM株、Flury株、SAD株、aG株、CVS株或CTN株；优选为CVS株，更优选为CVS-11株。

在一个优选的实施方式中，所述应用包括使用依曲韦林预防细胞感染 RABV；和/或抑制细胞中RABV的生长和增殖。优选使用依曲韦林预防N2A 细胞或BHK细胞感染RABV；和/或抑制N2A细胞或BHK细胞中RABV 的生长和增殖。BHK-21细胞中依曲韦林抗RABV的半数病毒滴度抑制浓度(IC

基于上述发明构思，本发明在一个方面还提供了依曲韦林在制备用于预防和/或缓解细胞RABV感染的药物中的应用以及在制备用于治疗和/或预防狂犬病的药物中的应用。在BHK-21细胞和N2A细胞上的细胞毒性实验结果表明依曲韦林的CC

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种抗RABV药物的筛选方法，包括如下步骤：

(a)使用荧光标记的RABV感染细胞；

(b)使用候选药物处理感染RABV的细胞；

(c)观察细胞的荧光强度。

本发明提供的筛选方法能够在荧光显微镜下直接观察细胞中外源表达的荧光蛋白。此外，与携带荧光素酶报告基因的重组病毒相比，检测荧光信号时，表达荧光蛋白的重组病毒不需要加入任何底物。所以，可以通过荧光显微镜以连续和非损害方式来分析和定量病毒的复制。其中荧光标记的RABV优选为荧光标记的CVS-11，更优选为EGFP标记的CVS-11重组病毒；感染的细胞优选为N2A细胞。通过实验发现重组CVS-11-EGFP在 N2A细胞上的生长曲线与CVS-11基本一致，无明显差别，因此 CVS-11-EGFP可以良好的模拟未经改造的CVS-11病毒株，避免由于EGFP 的引入导致的病毒性状的改变，从而降低药物筛选的准确度。

步骤(b)中候选药物例如可以为但不限于为化合物小分子，单链或双链的RNA或DNA片段，多肽和抗体等各种形式，本发明对此不做限制。使用候选药物处理感染病毒的细胞的步骤中，处理指的是本领域可接受的使用药物影响靶细胞的方式，例如直接将候选药物添加在细胞的培养基中或使用药物递送制剂使药物作用于被感染的细胞，本领域技术人员可以根据本领域的一般知识，选择候选药物作用于感染细胞的方式，本发明对此不做限制。

本发明不限制步骤(a)和步骤(b)的顺序，例如，当筛选预防RABV 的药物时，可以先使用候选药物处理细胞，再感染病毒，即先执行步骤(b) 再执行步骤(a)；当筛选能够抑制细胞中RABV增殖的药物时，可以先使细胞感染病毒，再使用候选药物处理细胞。

本发明提供的筛选方法还可以包括本领域可接受的其他用于验证药物抗病毒效果的实验步骤，例如，预先计算病毒滴度；采用荧光定量PCR法检测细胞中病毒mRNA的表达量；采用免疫印迹法研究细胞中病毒蛋白的表达量；和候选药物的细胞毒性实验等。

在一个优选的实施方式中，所述筛选方法包括如下步骤：

(a)使用EGFP标记的CVS-11重组RABV感染N2A细胞；

(b)使用候选药物处理感染CVS-11重组RABV的N2A细胞；

(c)观察N2A细胞中的荧光强度。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和技术效果。

实验材料：

1、细胞：BHK-21(幼仓鼠肾细胞)，N2A细胞(小鼠神经瘤细胞)购于中国科学院细胞库，由申请人所在的实验室保存。

2、病毒：表达EGFP的重组狂犬病病毒CVS-11株(由夏咸柱院士实验惠赠，其构建方法参见文献Generation of recombinant rabies Virus CVS-11 expressing eGFPapplied to the rapid virus neutralization test[J].Viruses 2014,6,1578-1589)，-80℃保存。

3、培养基：含有5％(v/v)的胎牛血清(FBS)DMEM培养基，含终浓度为100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

4、小分子化合物库：抗病毒小分子化合物库(MCE公司，货号 HY-LD-000001562)终浓度为10mM的储存液，于-80℃保存备用。

实施例1

病毒培养及滴度测定

(1)N2A细胞或者BHK-21细胞提前一天按1:5传代至T25细胞培养瓶中，细胞密度为2×10

(2)细胞用PBS洗涤一次，按MOI＝0.1感染重组狂犬病病毒，37℃孵育1h。

(3)吸出病毒液，PBS洗涤两次，加入细胞维持液，放入37℃，5％CO

(4)将T25细胞培养瓶放入-80℃冰箱中反复冻融3次释放病毒，4℃， 3,000×g离心10min去除细胞碎片，再将病毒上清液装至1.5mL EP管中， -80℃冰箱中保存备用。

(5)按上述方法培养病毒3-4代，并测定病毒滴度。

(6)N2A细胞或者BHK-21细胞提前一天按1:5传代至96孔板中，细胞密度为2×10

(7)按上述病毒上清液按照1：10比例稀释，连续稀释至10

(8)将96孔板放入37℃，5％CO

实施例2

病毒的生长曲线及病毒合成

(1)N2A细胞提前一天按1:5传代至6孔板中，细胞密度为2×10

(2)细胞用PBS洗涤一次，按MOI＝0.1感染重组狂犬病病毒，37℃孵育1h。

(3)吸出病毒液，PBS洗涤两次，加入细胞维持液，放入37℃，5％CO

(4)病毒上清液按上述方法经病毒滴度测定，绘制病毒的生长曲线；蛋白上清液经免疫印迹实验(Western blotting)检测病毒蛋白的表达及绘制变化曲线如图1、图2和图3所示。

从图1的结果可以看出，重组狂犬病病毒CVS-11-EGFP在N2A细胞上的生长曲线与狂犬病病毒CVS-11基本一致，无明显差别。从图2可以看出，病毒P蛋白在感染后不同时间点的表达情况也基本一致，无明显差别。图1和图2结果表明，重组狂犬病病毒CVS-11-EGFP与正常CVS-11在N2A 细胞上增殖无明显差异。

实施例3

抗RABV活性化合物的筛选

(1)N2A细胞提前一天按1:5传代至96孔板中，细胞密度为2×10

(2)细胞用PBS洗涤一次，按MOI＝0.1感染重组狂犬病病毒，37℃孵育1h。

(3)吸出病毒液，PBS洗涤两次，加入用细胞维持液稀释的不同小分子化合物(总浓度10μM)，放入37℃，5％CO

(4)直接进行荧光显微镜观察并记录每个孔的荧光强度，初步判断其抗RABV的效果。

(5)重复上述抗RABV化合物筛选3次，最后确定抑制RABV的小分子化合物。

结果如图3所示，通过96孔板的高通量抗狂犬病病毒药物筛选，结果表明Etravirine(依曲韦林)具有明显地抑制重组狂犬病病毒荧光强度，而核苷类似物逆转录酶抑制剂Abacavir和非核苷逆转录酶抑制剂Delavirdine 和Nevirapine均无明显抑制作用。

实施例4

药物的细胞毒性

(1)N2A细胞或者BHK-21细胞提前一天按1:5传代至96孔板中，细胞密度为2×10

(2)以细胞维持液稀释具有抗RABV效果的化合物，终浓度分别为 80，40，20，10，5，2.5，1.25，0.625μM。每孔加入200μL稀释的化合物，每个浓度设置3个重复孔。

(3)将96孔板放入37℃，5％CO

(4)每孔加入50μL 10％冷三氯乙酸，4℃固定1h。

(5)弃固定液，用ddH

(6)加入100μL 0.4％SRB溶液，室温染色30min(平板振荡)。

(7)弃染色液，用1％乙酸洗涤未结合染色液，洗涤4次，室温风干 1h或更久。

(8)每孔加入100μL 10mM Trisbase(pH＝10.5)，室温染色10min(平板振荡)。

(9)在多功能酶标仪上测定515nm吸光度值(OD值)，用空白对照调零。

(10)根据每个化合物浓度的OD值，计算每个梯度的细胞抑制率。抑制率(％)＝(对照组OD值-化合物组OD值)/对照组OD值×100％。

(11)根据每个化合物浓度的细胞抑制率，通过非线性回归分析的剂量反应抑制曲线计算化合物的半数细胞毒性浓度(CC

实验结果如表1所示：在BHK-21和N2A细胞上的细胞毒性实验结果表明Etravirine的CC

实施例5

药物的抗病毒活性

(1)N2A细胞或者BHK-21细胞提前一天按1:5传代至12孔板中，细胞密度为2×10

(2)细胞用PBS洗涤一次，按MOI＝0.1感染狂犬病病毒CVS-11，37℃孵育1h。

(3)吸出病毒液，PBS洗涤两次，分别加入用细胞维持液稀释不同浓度(0，1.25，2.5，5，10μM)的抗RABV化合物，放入37℃，5％CO

(4)将12孔板放入-80℃冰箱中反复冻融4次释放病毒，4℃，3,000 ×g离心10min去除细胞碎片，再将病毒上清液装至1.5mL EP管中，-80℃冰箱中保存备用。

(5)通过直接免疫荧光实验测定每个梯度的病毒上清液的病毒滴度 (TCID

(6)根据化合物每个浓度的病毒滴度抑制率，通过线性回归分析的剂量反应曲线计算化合物的半数病毒滴度抑制浓度(IC

实验结果如表1所示：抗狂犬病病毒实验结果表明Etravirine的IC

表1 Etravirine的细胞毒性和抗狂犬病病毒活性

实施例6

实时荧光定量PCR检测CVS-11的P基因的mRNA表达量的变化

(1)N2A细胞提前一天按1:5传代至12孔板中，细胞密度为2×10

(2)按上述所示感染狂犬病病毒CVS-11，PBS洗涤后加入不同浓度化合物：Etravirine、Abacavir、Delavirdine和Nevirapine(0，2.5，5，10μM)。

(3)37℃，5％CO

(4)总RNA提取：①向1mL Trizol裂解的细胞中加入200μL三氯甲烷，震荡混匀室温静置5min；②4℃，12000×g离心10min，小心吸取上层清液600μL加至一个洁净的无RNA酶的1.5mL EP管中，加入等体积的异丙醇，轻轻震荡混匀；③将混合液加入至带有RNA制备管的离心管中；④4℃，10000×g离心30s，吸弃滤液；⑤向制备管中加入600μL Wash Buffer，4℃，10000×g离心30s，吸弃滤液；⑥重复洗涤一次；⑦将制备管放入离心管中空离1min；⑧将制备管放入一个新的1.5mL EP管中，加入40μL无RNA酶的水溶解，4℃，10000×g离心1min，测定RNA浓度进行反转录或者-80℃保存备用。

(5)反转录：反应条件：42℃90min，95℃5min。反转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR扩增或者-20℃保存备用。

(6)实时荧光定量PCR扩增：检测狂犬病病毒P基因mRNA的表达，反应条件：94℃10min，(94℃5s，60℃30s)共40个循环，94℃15s， 60℃1min，94℃15s。反应结束后分析结果，采用2

实验结果如图4所示，从图4可以看出，Etravirine能够显著的降低 CVS-11的P基因mRNA的表达量。

实施例7

免疫印迹实验(Western blotting)检测CVS-11P蛋白表达量的变化

(1)将上述收集的蛋白裂解液经4℃，13000×g离心10min后转移上清至一新的RNase-Free的离心管中，即得到细胞的总蛋白。

(2)蛋白定量：采用Bradford法①将考马斯亮蓝G-250染色液，蛋白标准品BSA(1mg/mL)放置室温平衡；②分别取0、1、2、3、5、10、15μg 蛋白标准品BSA放入洁净1.5mL离心管，待测样品取1μL加入洁净1.5mL 离心管中，并补充1×PBS至15μL；③再加入285μL考马斯亮蓝G-250染色液，充分混匀；④分别转移200μL混合液至96孔酶标板中，室温静置 5min后置于多功能酶标仪中；⑤于595nm处读取OD值，通过已知浓度 BSA及其OD值，绘制出蛋白浓度的标准曲线，并计算出每个样品的蛋白浓度。

(3)SDS-PAGE：①每个样品取总蛋白量40μg至洁净1.5mL离心管，分别加入一定量的5×SDS上样缓冲液，煮沸5min，12000×g离心5min；②配制12％SDS-PAGE分离胶溶液，迅速将其灌注到制胶器的两块玻璃板间隙中(不要产生气泡)，在分离胶上轻轻覆盖一层ddH

(4)转膜：①电泳结束后，取出凝胶，浸泡至1×电转液中；②按凝胶大小，裁剪大小一致的滤纸和硝酸纤维素膜，并浸泡至电转液中；③依次按滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸的顺序铺在电转仪上，并且每放一层需加电转液并且需赶掉气泡；④盖上盖子，接通电源，恒压20V转膜 20min；⑤转膜完成后，将硝酸纤维素膜置于1×PBS中取出残留的电转液。

(5)将硝酸纤维素膜置于Odyssey封闭液中，使其完全被覆盖，室温封闭3h。

(6)封闭完后，将硝酸纤维素膜置于Odyssey封闭液稀释的相应一抗中，置水平摇床上4℃缓慢摇晃过夜。

(7)用1×TBST洗涤膜3次，每次5min，再将膜置于Odyssey封闭液稀释的相应红色荧光标记的二抗中，室温闭光孵育1h。

(8)用1×TBST洗涤膜3次，每次5min，再将膜置于Odyssey双色红外激光成像系统中扫描，并调节、保存图片。

实验结果如图5所示，通过Western blotting检测病毒蛋白合成情况，结果表明Etravirine均具有明显地抑制狂犬病病毒CVS-11P蛋白合成的作用，而Abacavir，Delavirdine和Nevirapine无明显抑制作用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。