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法律状态信息
法律状态
2022-06-28
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及依曲韦林在制备抗蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和基孔肯雅热病毒感染药物中的应用。
背景技术
依曲韦林(Etravirine)是非核苷类逆转录酶抑制药，通过直接与病毒逆转录酶活性部位附近的疏水区结合使酶蛋白构象改变而失活，阻止了新的核苷酸的结合和双链DNA的聚合，具有抗HIV的作用。
蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus，TBEV)又称森林脑炎病毒，为黄病毒科黄病毒属。蜱传脑炎(TBE)是由TBEV引起的以中枢神经系统病变为主要特征的自然疫源性疾病。人感染病毒的主要途径是被携带TBEV的蜱虫叮咬，还可因摄入TBEV污染的奶制品而感染。TBE的分布具有明显的地域性，与传播媒介密切相关。近年来，在中国东北、俄罗斯东部及日本北部TBE 的发病呈现上升趋势，疫区范围也在不断扩大。目前用于预防TBEV感染的灭活疫苗的免疫原性较低，诱导中和抗体的维持时间较短，且在林区职业人群以外可能暴露人群的接种率较低。目前无TBE特异治疗药物。
西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)属黄病毒科黄病毒属，为单股正链 RNA病毒，可引起人和动物发生西尼罗河热和西尼罗病毒脑膜脑炎，库蚊是其主要的传播媒介，鸟类是该病毒的中间宿主，而人和马则是终端宿主。WNV病广泛分布于非洲、中东、欧洲的部分地区。1999年夏季，WNV首次登陆美国，随后几年内在北美和中美洲迅速传播，导致美国和加拿大等国家历史上虫媒病毒感染的最大流行。目前尚无针对WNV感染的人用疫苗以及治疗药物。虽然我国至今没有WNV感染疫情发生，但有输入性传播的可能。
黄热病毒(Yellow fever virus,YFV)是以伊蚊为媒介在虫媒传染病毒，与寨卡病毒(ZIKV)、西尼罗河病毒(WNV)和登革热病毒(DENV)等同属黄病毒科黄病毒属，均以蚊为传播媒介，当前主要流行于非洲和南美洲的热带、亚热带地区。黄热病毒可引起严重危害人类健康的黄热病，表现为黄疸，出血、甚至多系统的器官衰竭。虽有减毒疫苗，但疫苗在流行区的接种覆盖率有限，每年均有疫情发生。我国近年来曾有多例输入性感染者。目前尚无针对YFV感染的特异治疗药物。
基孔肯雅热病毒(Chikungunya fever virus,CHIKV)是一种单股正链RNA 病毒，可致基孔肯雅热，虽致死率不高，但被感染人群丧失劳动力，导致严重的社会影响与经济损失。CHIKV是一种蚊媒病毒，主要由埃及伊蚊和白蚊伊蚊传播给人类，1952-1953年在坦桑尼亚首次分离，随后在非洲和亚洲地区爆发流行。2005年后CHIKV再次在全球多地数次爆发，并在法国、意大利、中国出现散在的输入性病例，特别是CHIKV东中南非型E1蛋白发生突变(E1-A226V) 使其可有效通过白蚊伊蚊传播，不仅对热带和亚热带地区，还对白蚊伊蚊广泛存在的温带地区的民众构成了潜在威胁。目前尚无针对CHIKV感染的疫苗以及特异治疗药物。
发明内容
本发明旨在提供一种依曲韦林的新用途。
本发明提供了依曲韦林在制备抗蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和基孔肯雅热病毒感染药物中的应用。
所述依曲韦林的化学结构式如下：
本发明涉及的应用，其特征在于：上述抗蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和基孔肯雅热病毒感染药物是以依曲韦林为唯一的活性成份，或包含依曲韦林的药物组合物。
本发明涉及的应用，其特征在于：上述包含依曲韦林的药物组合物是指依曲韦林与药学上允许的一种或多种辅料构成的药物组合物。
本发明涉及的应用，其特征在于：上述药物用于预防或治疗蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和基孔肯雅热病毒的感染。
本发明涉及的应用，其特征在于：上述抗蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和基孔肯雅热病毒感染药物中依曲韦林的含量为0.1～99wt％。
本发明涉及的应用，其特征在于：上述药物的给药剂型选自散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂。
本发明涉及的应用，其特征在于：上述药物的给药途径剂型选自注射给药剂型、胃肠道给药剂型、皮肤给药剂型。
本发明的作用和效果：
本发明利用TBEV感染易感细胞的实验操作体系，从临床批准的药物小分子库中筛选可抑制TBEV感染的候选小分子药物，筛选出依曲韦林能有效抑制 TBEV对人肝癌细胞Huh7感染，且细胞毒性较小，并且对WNV、YFV、CHIKV 均具有抑制作用，可作为潜在的抗TBEV、WNV、YFV、CHIKV药物，具有应用前景。
附图说明
图1.依曲韦林保护BHK细胞抵抗蜱传脑炎病毒感染的效果；
即BHK细胞以蜱传脑炎病毒感染，同时加入依曲韦林或溶剂DMSO，或不以蜱传脑炎病毒感染(未加病毒)，72小时后加入CCK8试剂，检测450nm吸光值。
图2.依曲韦林对Huh7细胞的毒性；
即依曲韦林以及溶剂DMSO分别处理Huh7细胞，72小时后加入CCK8试剂，检测450nm吸光值。
图3.依曲韦林在Huh7细胞感染模型中对蜱传脑炎病毒的抑制作用。
图4.依曲韦林抑制蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、基孔肯雅热病毒感染的效果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本发明实施例所用的依曲韦林可以通过市售方式购买获得。
一、病毒、药物、试剂及其他材料
1.病毒：蜱传脑炎病毒、黄热病毒由中国人民解放军海军军医大学生物医学防护教研室分离和扩增培养，西尼罗病毒、基孔肯雅热病毒利用反向遗传学技术合成，由幼仓鼠肾BHK细胞扩增培养。所有涉及病毒感染的实验操作均在海军军医大学P3实验室中进行。
2.化合物：978种美国FDA化学药物分子库，购自美国Selleck公司。
3.人肝癌细胞系Huh7和幼仓鼠肾BHK细胞，购自中国科学院上海细胞所，由中国人民解放军海军军医大学生物医学防护教研室保存。
4.DMEM细胞培养液为美国Hyclone公司产品，用时添加10％胎牛血清、非必需氨基酸、氨苄青霉素和链霉素(各100U/ml)，培养液添加剂均为美国 Thermo Fisher公司产品。
5.细胞消化液，含0.25％胰蛋白酶，用磷酸盐缓冲液配制。
6.CCK8细胞活性和增殖检测试剂盒为美国MedChemExpress公司产品。
7.小鼠蜱传脑炎病毒多克隆抗体、西尼罗病毒多克隆抗体、黄热病毒多克隆抗体、基孔肯雅热病毒多克隆抗体由中国人民解放军海军军医大学生物医学防护教研室用甲醛灭活的蜱传脑炎病毒免疫小鼠而制备。
8.荧光素Alexa Fluor 488-标记的抗小鼠IgG为美国Thermo Fisher公司产品。
二、实验方法：
(一)从含978个小分子化合物的FDA药物小分子库中筛选抗蜱传脑炎病毒药物
用完全DMEM培养液在T75细胞培养瓶内传代培养幼仓鼠肾BHK细胞，接种于96孔板，每孔10000个细胞，DMEM培养液100μL，培养12小时。随后每孔加入50μL含1000PFU(空斑形成单位)蜱传脑炎病毒的完全DMEM培养液；同时加入50μL含FDA小分子化学药物的完全DMEM培养液，药物终浓度为10μM，每个浓度重复3孔，以加等体积溶剂DMSO作为不加药物的对照。置于37℃、5％CO
(二)依曲韦林对细胞的毒性
分别将培养的人肝癌细胞系Huh7和幼仓鼠肾BHK细胞接种于96孔板，每孔10000个细胞，培养液100μL，12小时后，吸除原培养液，每孔内加入浓度梯度稀释的依曲韦林的完全DMEM培养液100μL，依曲韦林终浓度分别为2.5、 5、10、20、40和80μM，每个浓度重复3孔，以80μM药物的溶剂DMSO含量作为不加药物的对照。置于37℃、5％CO
结果显示，当浓度等于或低于80μM时，依曲韦林处理的两种细胞与DMSO 溶剂处理的细胞均无明显差异。图2显示80μM时，依曲韦林处理的Huh7细胞与DMSO溶剂处理细胞的450nm吸光值。
(三)依曲韦林在细胞感染模型中对蜱传脑炎病毒的抑制作用
将传代培养的人肝癌细胞系Huh7接种于96孔板，每孔10000个细胞，培养液100μL，培养12小时。随后每孔加入50μL含1000PFU蜱传脑炎病毒的完全DMEM培养液；同时加入50μL含依曲韦林的完全DMEM培养液，药物终浓度为5μM，每个浓度重复3孔，以加等体积溶剂DMSO作为不加药物的对照，置于37℃、5％CO
20小时后，用免疫荧光技术检测病毒对细胞的感染情况，具体操作如下：吸除培养板中的培养液，每孔加100μL甲醇，将培养板至于-20℃冰箱，20分钟后，取出培养板，吸除甲醇，每孔以磷酸盐缓冲液(PBS)洗孔一次，随后加入100μL含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(以下简称3％BSA-PBS)，置于水平摇床上，室温缓慢摇1小时，吸除培养板中的3％BSA-PBS，每孔加100μL 含抗蜱传脑炎病毒多克隆抗体的1％BSA-PBS(抗体500倍稀释)，室温缓慢摇1小时，吸除培养板中的抗蜱传脑炎病毒多克隆抗体工作液，每孔以PBS洗3 次，随后加入100μL含荧光素Alexa Fluor488-标记的抗小鼠IgG的1％BSA-PBS (荧光素抗体1500倍稀释)，室温避光缓慢摇1小时，吸除培养板中的荧光素抗体工作液，每孔加入DAPI细胞核染色液100μL，室温避光缓慢摇10分钟，吸除培养板中的DAPI细胞核染色液，每孔以PBS洗3次，用细胞成像及分析系统(BioTek Cytation 5 Imaging Reader)对每孔细胞的荧光分布进行拍照。每孔拍照四个视野，分析、计算绿色荧光阳性细胞的百分率，即病毒感染率。
结果如图3所示，与作为对照的DMSO溶剂处理孔相比，依曲韦林处理病毒感染率明显降低。结果证明，在5μM浓度时，依曲韦林能显著抑制蜱传脑炎病毒对Huh7细胞的感染。
(四)依曲韦林抑制蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、基孔肯雅热病毒感染活性的定量测定
为了观察依曲韦林对蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、基孔肯雅热病毒是否具有抗抑制活性，我们进一步对依曲韦林进行了抗蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、基孔肯雅热病毒活性的量化检测，即通过检测不同浓度时的抗病毒活性，计算药物对病毒的半数抑制浓度(IC50)。药物设置了连续五倍稀释的四个浓度梯度0.2、1、5、25μM。检测方法中，除了药物处理设置浓度梯度外，其他与(三)中所述相同。病毒感染的细胞经病毒抗体和荧光抗体结合以及细胞核染色以后，用细胞成像及分析系统进行细胞拍照，每孔拍照四个视野，分析、计算绿色荧光阳性细胞的百分率，即病毒感染率(图4)。根据各浓度梯度药物处理孔的阳性细胞百分率，计算出依曲韦林对蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、基孔肯雅热病毒的IC50；蜱传脑炎病毒IC50：2.17μM；西尼罗病毒IC50：4.76μM；黄热病毒IC50：4.59μM；基孔肯雅热病毒IC50： 5.56μM。
上述体外和体内实验结果均表明，依曲韦林具有显著的蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、基孔肯雅热病毒感染的活性，可用于制备抗蜱传脑炎病毒感染的药物，用于蜱传脑炎病毒感染的预防和治疗。
以上显示和描述了本发明的主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
