抗猪伪狂犬病毒药物高通量筛选方法的建立及初步应用

摘要

伪狂犬病毒属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科水痘病毒属成员，是一种重要的动物传染病病原，其基因组是双链DNA，大小约150kb，G+C含量高达74.5％，具有70多个开放阅读框，能够编码70～100种蛋白质。猪是该病原的自然储存宿主。迄今世界上已有超过40个国家和地区报道过猪伪狂犬病，该病给我国养猪业带来了巨大的经济损失。目前对该病的预防与控制主要是通过疫苗接种实现，国内外已研制成功了常规弱毒苗和基因缺失苗等，这些疫苗在猪伪狂犬病的防控中起了重要作用。
　　人类对抗单纯疱疹病毒药物的研究已有半个世纪，目前已成功研制了多种化学药物用于治疗单纯疱疹病毒局部或全身感染。本研究希望借鉴抗单纯疱疹病毒药物的研究模式来研究治疗猪伪狂犬病毒感染的化学药物。
　　基于此，本课题主要开展了以下3个方面的研究。
　　1.抗猪伪狂犬病毒药物高通量筛选方法的建立
　　为建立一种适合在细胞水平上筛选抗PRV抑制剂的模型，通过确定合适的PK-15和IBRS-2细胞接种密度、检测终点、优化PRV的感染剂量以及DMSO对细胞活力的影响，最终确定在96孔细胞培养板上接种100μL/孔，5x104个/mL的PK-15和IBRS-2细胞，培养24h后换上细胞维持液，加入感染剂量为0.01个MOIs的病毒液并控制 DMSO的浓度≤1%，培养至72h后检测细胞活力。检测结果显示S/B为24.75、Z′因子为0.68、细胞CV值和病毒CV值分别为9.94%和10.0%，满足高通量筛选S/B＞5、Z′≥0.5和CV＜10%的要求。
　　2.化合物库的筛选
　　根据上述已建立的细胞模型，对1280种化合物进行了筛选：
　　初筛：96孔细胞培养板上接种PK-15细胞，培养24h后换成细胞维持液，加入化合物和0.01个MOIs的病毒液，72h内在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照保存。初筛结果显示有48种化合物对PRV有抑制作用。
　　复筛：96孔细胞培养板上接种IBRS-2细胞，培养24h后换成细胞维持液，加入化合物和0.01个MOIs病毒液，培养至72h后检测。试验结果显示48种化合物中对PRV的抑制率在20%以上的有6种，其中抑制率在50%以上的有2种。
　　3.抗猪伪狂犬病毒化合物的鉴定
　　化合物对细胞的毒性试验：96孔细胞培养板上接种细胞，培养24h后换成细胞维持液，加入化合物并连续二倍比稀释，培养至72h后检测。试验结果显示利巴韦林、阿昔洛韦、溴乙烯脱氧尿苷、螺内酯和酪氨酸磷酸化抑制剂AG555对IBRS-2细胞毒性CC50分别是45.93μM、54.93μM、168.4μM、25.42μM和32.02μM。
　　剂量效应试验：96孔细胞培养板上接种IBRS-2细胞，培养24h后换成细胞维持液，加入化合物并连续二倍比稀释，同时加入0.01个MOIs病毒液，培养至72h后检测。试验结果显示利巴韦林、溴乙烯脱氧尿苷、螺内酯和酪氨酸磷酸化抑制剂AG555的最大抑制率分别为14.08%、70.16%、30.58%和24.65%，阿昔洛韦对PRV无抑制作用。
　　空斑减少试验：传代IBRS-2细胞于12孔细胞培养板，待细胞铺满单层后弃去旧培养基，加入10-6稀释的PRV病毒液300μL/孔，分别在病毒作用细胞0h、1h和6h后加入1mL无酚红DMEM培养基，其中培养基内含有各种不同浓度的化合物，继续培养2-3天，空斑计数。试验结果显示阿昔洛韦对PRV无抑制作用，利巴韦林对PRV有一定程度抑制作用，溴乙烯脱氧尿苷对PRV抑制效果显著；螺内酯和酪氨酸磷酸化抑制剂AG555对PRV增殖的早期有抑制作用。

目录

声明

缩略词（Abbreviation）

第 1 章 文献综述

1.1 伪狂犬病

1.2 抗病毒药物研究与应用进展

1.3 抗疱疹病毒药物研究进展

1.4 药物筛选研究

第 2 章 研究目的与意义

第 3 章 材料与方法

3.1 试验材料

3.2 试验方法

第四章 结果与分析

4.1 细胞接种密度的确定

4.2 PRV感染剂量的确定

4.3 细胞对DMSO的敏感性分析

4.4 初筛

4.5 复筛

4.6 化合物对细胞的毒性试验

4.7 剂量效应关系研究

4.8 空斑减少试验

第5章 讨论与结论

5.1 讨论

5.2 结论

参考文献

致谢