HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法

摘要

本发明公开了HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法，包括以下步骤：步骤1：基于HMGB1真核表达质粒的瞬时转染和RNAi干扰，检测HMGB1的表达水平；步骤2：利用HMGB1和自噬抑制剂3‑MA分别与奥沙利铂联合用药后对移植瘤及裸鼠生长影响；步骤3：通过透射电子显微镜观察自噬体的形成：本发明通过体外细胞实验和耐药移植瘤模型的建立，观察HMGB1诱导的自噬对奥沙利铂敏感性的影响，明确HMGB1在奥沙利铂诱导的自噬反应中的作用，阐明奥沙利铂诱导HMGB1基因转录调控以HMGB1通过MEK/ERK途径调控CRC细胞自噬的分子机制，为化疗耐药理论研究提供新的思路，为临床治疗耐药肿瘤提供新的靶点，具有重要的理论意义和现实意义。

说明书

技术领域

本发明属于医疗技术领域，具体涉及HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法。

背景技术

结直肠癌(CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率仅次于胃癌和食道癌，高居全球恶性肿瘤的第四位，每年因CRC死亡的人数约50万人；手术及辅助治疗可大大提高早期CRC患者生存率，但晚期患者手术后复发风险依然较高；目前，药物治疗是CRC的主要治疗手段，然而，耐药性的产生大大限制了其治疗效果；因此，更好的理解产生耐药性的潜在机制对成功治疗CRC具有重要临床意义。

奥沙利铂是目前临床上CRC化疗的基础药物之一，并且在CRC治疗中取得了可观效果，但肿瘤固有性及获得性耐药影响了奥沙利铂对CRC的治疗效果和预后，患者结局并不理想；目前，有多种关于CRC细胞产生奥沙利铂耐药机制的假设，其中，自噬是其研究热点之一，高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是一种高度保守的核蛋白，在炎症、细胞迁移、细胞分化、自噬及癌细胞转移等多种生物学过程中均发挥重要作用；研究表明，HMGB1在CRC细胞介导自噬增加化疗药物耐药性中发挥着重要作用，但其具体机制尚不十分明确，因此提出HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法，以解决上述背景技术中提出的HMGB1在CRC细胞介导自噬增加化疗药物耐药性中发挥着重要作用，但其具体机制尚不十分明确的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法，包括以下步骤：

步骤1：基于HMGB1真核表达质粒的瞬时转染和RNAi干扰，检测HMGB1的表达水平；

步骤2：利用HMGB1和自噬抑制剂3-MA分别与奥沙利铂联合用药后对移植瘤及裸鼠生长影响；

步骤3：通过透射电子显微镜观察自噬体的形成；

步骤4：流式细胞术检测奥沙利铂对敏感细胞和耐药细胞凋亡的影响；

步骤5：不同HMGB1荧光素酶报告基因及其CRC稳定细胞株的构建；

步骤6：奥沙利铂影响CRC细胞HMGB1转录调控的基因片段、顺式作用元件和转录因子的鉴定；

步骤7：MAPKs和mTOR通路活性的检测；

步骤8：监测奥沙利铂治疗前、后临床患者血清中HMGB1蛋白浓度变化；

步骤9：统计学分析。

优选的，所述步骤1包括以下步骤：

步骤1.1：细胞培养：CRC细胞柱HT29、HCT116、SW620常规培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并加入2ml谷氨酰胺，1％双抗(青霉素和链霉素的浓度均为100U/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中恒温培养，48～72h传代，实验细胞均为活力良好的对数生长期细胞；

步骤1.2：细胞转染：取对数生长期HCT116和SW620细胞，胰酶消化后接种于6孔板中，待细胞密度达到60％左右时，使用转染试剂Lipofectamine2000将对照shRNA(sh-NC)、敲降HMGB1的shRNA(sh-HMGB1)对人结直肠癌细胞株HCT116和SW620进行转染，所有操作均严格遵守操作说明及流程进行；

步骤1.3：将转染后细胞板置于37℃、5％CO2培养箱中培养18～48小时，保证细胞的转染效率均达80％以上，用RT-qPCR法来检测mRNA水平，具体包括用TRIzol试剂提取各组细胞中总RNA，并使用紫外分光光度计检测RNA浓度，然后取1μgRNA样品逆转录制备cDNA，参照试剂盒说明书设置反应体系，进行RT-qPCR检测各样本中HMGB1 mRNA表达，(正向引物：5’-TATGGCAAAAGCGGACAAGG-3’，反向引物：5’-CTTCGCAACATCACCAATGGA-3’)，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法进行定量；

步骤1.4：采用蛋白凝胶印迹和免疫荧光共聚焦显微镜测定HMGB1表达，具体包括将细胞加入12孔板，细胞培养箱中培养24h，无血清饥饿处理3h后，加入35μM的奥沙利铂，37℃处理24h，随后使用4％多聚甲醛固定，0.1％Triton X-100通透，3％BSA封闭，加入预先稀释好的HMGB1抗体，并用Alexa Fluor488或546耦联二抗检测，最后用共聚焦荧光显微镜观察分析。

优选的，所述步骤2包括以下步骤：

步骤2.1：选择4～6周龄BALB/c nu/nu雌性裸鼠48只(分为6组，每组8只)，将肿瘤细胞悬液接种到裸鼠的背部皮下，每只裸鼠接种肿瘤细胞的细胞数为2x106；

步骤2.2：每三天用游标卡尺测量一次肿瘤大小，肿瘤大小按照以下公式计算：V＝LxW2/2，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤纵轴长度，W是肿瘤横轴长度；

步骤2.3：当肿瘤体积均值达到约130mm3，开始药物处理，给药方案如下：(1)对照组；(2)奥沙利铂给药组；(3)HMGB1给药组；(4)3-MA给药组；

(5)奥沙利铂和HMGB1联合给药组；(6)奥沙利铂和3-MA联合给药组；

步骤2.4：给药过程中按步骤2.2中的方法每三天测量肿瘤大小，除了检测肿瘤体积这一指标外，还检测肿瘤组织中的细胞自噬体；

步骤2.5：在所有给药过程结束，取出肿瘤组织并处死裸鼠，肿瘤组织切片后透射电子显微镜观察自噬体的形成情况。

优选的，所述步骤3包括以下步骤：

步骤3.1：取对数生长期CRC细胞HT29和HCT116，预实验中选择的合适细胞数接种于60mm培养皿中；

步骤3.2：35μM oxaliplatin处理48h后，收集细胞，低速离心弃上清；

步骤3.3：细胞沉淀以2.5％的戊二醛溶液固定过夜，再以1％四氧化锇溶液处理，固定细胞2次；

步骤3.4：最后采用梯度乙醇溶液脱水后以环氧树脂812包埋细胞，制成100nm超薄切片，用饱和的醋酸铅和醋酸双氧铀溶液染色后，在透射电子显微镜下观察细胞自噬体的形成并摄片。

优选的，所述步骤4包括以下步骤：

步骤4.1：取对数生长期CRC细胞HT29和HCT116，预实验中选择的合适细胞数接种于60mm培养皿中；

步骤4.2：35μM oxaliplatin处理48h后，撤去药物，分别于第1、2和4天后收集细胞，用不含EDTA Trypsin消化，收集在15ml离心管中离心后转移至流式管，lx BingingBuffer 100μl/Tube加入流式管中悬浮细胞，加入PI2.5，μl/Tube，FITC 2.5μl/Tube，室温放置10min；

步骤4.3：最后以400μl/Tube加入1x Binging Buffer，流式细胞仪上样检测。

优选的，所述步骤5包括以下步骤：

步骤5.1：设计多个3’-端固定的HMGB1调控引物，以CRC细胞基因组DNA为模板，PCR扩增不同长度HMGB1调控基因(-83～+83、-383～+83、-688～+83、-975～+83、-1163～+83、-1327～+83、-1520～+83)，均将其连入pMD18-T载体，并转化宿主菌DH5a，氨苄青霉素筛选，阳性克隆并提取质粒，经KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序验证；

步骤5.2：正确的阳性克隆经KpnⅠ/HindⅢ双酶切后，连入pGL3-neo-luc报告基因的KpnⅠ/HindⅢ位点之间，构建含不同HMGB1调控基因的荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-luc质粒；

步骤5.3：同样-1520～+83HMGB1调控基因经XhoⅠ/HindⅢ双酶切后，连入pGL3-neo-luc报告基因的XhoⅠ/HindⅢ位点之间，构建出含-504～+83HMGB1的pGL3-HMGB1-luc质粒；

步骤5.4：转染不同pGL3-HMGB1-luc和pGL3-neo-luc报告基因质粒至CRC细胞，48h后加入终浓度600μg/ml的G418进行药物加压筛选20d，然后选取单个阳性克隆细胞。

优选的，所述步骤6包括以下步骤：

步骤6.1：奥沙利铂耐药CRC细胞经固定、超声和染色体免疫共沉淀(ChIP)处理后获得纯化的DNA；

步骤6.2：通过特异性引物，RT-PCR扩增中心位点于-1103和-797处的HMGB1基因，寻找奥沙利铂富集在HMGB1的基因部位；

步骤6.3：应用生物信息学初步分析HMGB1-1163～-975区段的反式作用因子结合位点，对其启动子区域顺式作用元件实施缺失突变，寻找奥沙利铂影响CRC细胞HMGB1基因转录的关键转录因子。

优选的，所述步骤7具体包括奥沙利铂处理细胞后，收集细胞并提取总蛋白，分别使用抗ERK1/2、phospho-ERK1/2；p38、phospho-p38；JNK、phospho-JNK；mTOR、phospho-mTOR(ser2481)；S6K、phospho-S6K；4E-BP1、phospho-4E-BP1；Beclin1/2和phospho-Beclin1/2的单克隆抗体，采用western blot的方法，检测蛋白的磷酸化来反应通路的激活或抑制。

优选的，所述步骤8包括以下步骤：

步骤8.1：临床确诊为CRC患者100例纳入研究对象，分别于奥沙利铂化疗前后清晨空腹抽新鲜静脉血2ml，离心分离血清，-20℃冰箱保存备用；

步骤8.2：检测过程严格照试剂盒说明书操作：采用双抗体夹心法检测，用TMB显色，酶标仪在波长450nm处检测OD值，用CurveExpert软件分析，得到标准曲线的直线回归方程式，进而求得血清HMGB1的实际浓度。

优选的，所述步骤9具体为采用GraphPad Prism 6.0或IBM SPSS 22软件包进行数据分析,数据结果以均数±标准差(Mean±SD)表示，两组之间均数比较采用两样本t检验，三组及以上均数比较采用ANOVA分析，检验水准P﹤0.05。

与现有技术相比，本发明提供了HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法，具备以下有益效果：

1、本发明通过体外细胞实验和耐药移植瘤模型的建立，观察HMGB1诱导的自噬对奥沙利铂敏感性的影响，明确HMGB1在奥沙利铂诱导的自噬反应中的作用，阐明奥沙利铂诱导HMGB1基因转录调控以HMGB1通过MEK/ERK途径调控CRC细胞自噬的分子机制，为化疗耐药理论研究提供新的思路，为临床治疗耐药肿瘤提供新的靶点，具有重要的理论意义和现实意义；

2、本发明通过构建不同长度HMGB1调控序列的荧光素酶报告基因，观察奥沙利铂对CRC细胞中HMGB1基因的转录调控情况，应用结合染色体免疫共沉淀(ChIP)寻找起关键作用的HMGB1调控部位，通过生物信息分析关键HMGB1区段的顺式作用元件及对应的转录因子，进行单个顺式作用元件的缺失突变，寻找和鉴定奥沙利铂在HMGB1基因中启动子结合位点；

3、本发明应用基因转染和RNAi干扰技术改变CRC细胞中HMGB1的表达水平，检测磷酸化的细胞外信号调节激酶(pERK)和mTOR、phospho-mTOR等水平变化，应用(MEK,MAPK激酶,ERK)抑制剂PD98059及U0126处理细胞。观察HMGB1是否直接调控了ERK磷酸化的发生；

4、本发明征集临床确诊为CRC患者为研究对象，监测奥沙利铂治疗前、后患者血清中HMGB1蛋白浓度变化，为临床进一步诊断、治疗和预测耐药肿瘤的预后奠定基础。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：

图1为本发明提出的HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法的研究路线示意图；

图2为本发明提出的HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法中Westernblot法检测自噬相关蛋白表达的结果显示图；

图3为本发明提出的HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法中检测细胞增殖活性和凋亡的结果显示图；

图4为本发明提出的HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法中检测细胞凋亡的结果显示图；

图5为本发明提出的HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法中HMGB1的表达水平测试结果显示图；

图6为本发明提出的HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法中荧光显微镜观察HMGB1释放的结果显示图；

图7为本发明提出的HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法中RT-PCR结果显示图；

图8为本发明提出的HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法中MEK1/2被磷酸化的显示结果图；

图9为本发明提出的HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法中MEK1/2沉默后的结果显示图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

请参阅图1，本发明提供一种技术方案：HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法，包括以下步骤：

步骤1：基于HMGB1真核表达质粒的瞬时转染和RNAi干扰，检测HMGB1的表达水平；

步骤2：利用HMGB1和自噬抑制剂3-MA分别与奥沙利铂联合用药后对移植瘤及裸鼠生长影响；

步骤3：通过透射电子显微镜观察自噬体的形成；

步骤4：流式细胞术检测奥沙利铂对敏感细胞和耐药细胞凋亡的影响；

步骤5：不同HMGB1荧光素酶报告基因及其CRC稳定细胞株的构建；

步骤6：奥沙利铂影响CRC细胞HMGB1转录调控的基因片段、顺式作用元件和转录因子的鉴定；

步骤7：MAPKs和mTOR通路活性的检测；

步骤8：监测奥沙利铂治疗前、后临床患者血清中HMGB1蛋白浓度变化；

步骤9：统计学分析。

本发明的工作原理及使用流程：使用时，基于HMGB1真核表达质粒的瞬时转染和RNAi干扰，检测HMGB1的表达水平，利用HMGB1和自噬抑制剂3-MA分别与奥沙利铂联合用药后对移植瘤及裸鼠生长影响，通过透射电子显微镜观察自噬体的形成，通过流式细胞术检测奥沙利铂对敏感细胞和耐药细胞凋亡的影响，不同HMGB1荧光素酶报告基因及其CRC稳定细胞株的构建，进行MAPKs和mTOR通路活性的检测，监测奥沙利铂治疗前、后临床患者血清中HMGB1蛋白浓度变化，通过体外细胞实验和耐药移植瘤模型的建立，观察HMGB1诱导的自噬对奥沙利铂敏感性的影响，明确HMGB1在奥沙利铂诱导的自噬反应中的作用，阐明奥沙利铂诱导HMGB1基因转录调控以HMGB1通过MEK/ERK途径调控CRC细胞自噬的分子机制，为化疗耐药理论研究提供新的思路，为临床治疗耐药肿瘤提供新的靶点，具有重要的理论意义和现实意义。

实施例二

请参阅图1、图5、图6和图7，本发明提供一种技术方案：HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法，包括以下步骤：

步骤1：基于HMGB1真核表达质粒的瞬时转染和RNAi干扰，检测HMGB1的表达水平；

步骤2：利用HMGB1和自噬抑制剂3-MA分别与奥沙利铂联合用药后对移植瘤及裸鼠生长影响；

步骤3：通过透射电子显微镜观察自噬体的形成；

步骤4：流式细胞术检测奥沙利铂对敏感细胞和耐药细胞凋亡的影响；

步骤5：不同HMGB1荧光素酶报告基因及其CRC稳定细胞株的构建；

步骤6：奥沙利铂影响CRC细胞HMGB1转录调控的基因片段、顺式作用元件和转录因子的鉴定；

步骤7：MAPKs和mTOR通路活性的检测；

步骤8：监测奥沙利铂治疗前、后临床患者血清中HMGB1蛋白浓度变化；

步骤9：统计学分析。

本发明中，优选的，步骤1包括以下步骤：

步骤1.1：细胞培养：CRC细胞柱HT29、HCT116、SW620常规培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并加入2ml谷氨酰胺，1％双抗(青霉素和链霉素的浓度均为100U/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中恒温培养，48～72h传代，实验细胞均为活力良好的对数生长期细胞；

步骤1.2：细胞转染：取对数生长期HCT116和SW620细胞，胰酶消化后接种于6孔板中，待细胞密度达到60％左右时，使用转染试剂Lipofectamine 2000将对照shRNA(sh-NC)、敲降HMGB1的shRNA(sh-HMGB1)对人结直肠癌细胞株HCT116和SW620进行转染，所有操作均严格遵守操作说明及流程进行；

步骤1.3：将转染后细胞板置于37℃、5％CO2培养箱中培养18～48小时，保证细胞的转染效率均达80％以上，用RT-qPCR法来检测mRNA水平，具体包括用TRIzol试剂提取各组细胞中总RNA，并使用紫外分光光度计检测RNA浓度，然后取1μg RNA样品逆转录制备cDNA，参照试剂盒说明书设置反应体系，进行RT-qPCR检测各样本中HMGB1 mRNA表达，(正向引物：5’-TATGGCAAAAGCGGACAAGG-3’，反向引物：5’-CTTCGCAACATCACCAATGGA-3’)，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法进行定量；

步骤1.4：采用蛋白凝胶印迹和免疫荧光共聚焦显微镜测定HMGB1表达，具体包括将细胞加入12孔板，细胞培养箱中培养24h，无血清饥饿处理3h后，加入35μM的奥沙利铂，37℃处理24h，随后使用4％多聚甲醛固定，0.1％Triton X-100通透，3％BSA封闭，加入预先稀释好的HMGB1抗体，并用Alexa Fluor 488或546耦联二抗检测，最后用共聚焦荧光显微镜观察分析。

本发明的工作原理及使用流程：使用时，首先准备研究材料，人结直肠癌细胞株HT29、HCT116、SW620，奥沙利铂和自噬抑制剂3-MA，HMGB1蛋白，核酸提取试剂盒和Western试剂盒，LC3I/II抗体，p62抗体，转染试剂Lipofectamine 2000，逆转录试剂盒，MTT试剂盒购，RPMI-1640培养基及胎牛血清，Annexin-V-FITC/PI凋亡检测试剂盒，然后将CRC细胞柱HT29、HCT116、SW620常规培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并加入2ml谷氨酰胺，1％双抗(青霉素和链霉素的浓度均为100U/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中恒温培养，48～72h传代，实验细胞均为活力良好的对数生长期细胞，取对数生长期HCT116和SW620细胞，胰酶消化后接种于6孔板中，待细胞密度达到60％左右时，使用转染试剂Lipofectamine2000将对照shRNA(sh-NC)、敲降HMGB1的shRNA(sh-HMGB1)对人结直肠癌细胞株HCT116和SW620进行转染，所有操作均严格遵守操作说明及流程进行；将转染后细胞板置于37℃、5％CO2培养箱中培养18～48小时，保证细胞的转染效率均达80％以上，用RT-qPCR法来检测mRNA水平，具体包括用TRIzol试剂提取各组细胞中总RNA，并使用紫外分光光度计检测RNA浓度，然后取1μg RNA样品逆转录制备cDNA，参照试剂盒说明书设置反应体系，进行RT-qPCR检测各样本中HMGB1 mRNA表达，(正向引物：5’-TATGGCAAAAGCGGACAAGG-3’，反向引物：5’-CTTCGCAACATCACCAATGGA-3’)，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法进行定量；并且采用蛋白凝胶印迹和免疫荧光共聚焦显微镜测定HMGB1表达，具体包括将细胞加入12孔板，细胞培养箱中培养24h，无血清饥饿处理3h后，加入35μM的奥沙利铂，37℃处理24h，随后使用4％多聚甲醛固定，0.1％Triton X-100通透，3％BSA封闭，加入预先稀释好的HMGB1抗体，并用Alexa Fluor 488或546耦联二抗检测，最后用共聚焦荧光显微镜观察分析，分别从mRNA水平和蛋白水平检测HMGB1的表达，实验结果如图5、图6和图7所示，结果显示，与奥沙利铂未处理组相比，奥沙利铂处理组HMGB1在胞浆和胞外上清中的表达水平均显著升高，奥沙利铂组细胞HMGB1的释放较奥沙利铂未处理组亦显著升高，与奥沙利铂未处理组相比，奥沙利铂处理组HMGB1mRNA表达水平显著升高(P<0.001)组见差异有统计学意义，以上结果表明，奥沙利铂可诱导自噬调控因子HMGB1表达增加和转位。

实施例三

请参阅图1-9，本发明提供一种技术方案：HMGB1介导自噬对奥沙利铂敏感性的研究方法，包括以下步骤：

步骤1：基于HMGB1真核表达质粒的瞬时转染和RNAi干扰，检测HMGB1的表达水平；

步骤2：利用HMGB1和自噬抑制剂3-MA分别与奥沙利铂联合用药后对移植瘤及裸鼠生长影响；

步骤3：通过透射电子显微镜观察自噬体的形成；

步骤4：流式细胞术检测奥沙利铂对敏感细胞和耐药细胞凋亡的影响；

步骤5：不同HMGB1荧光素酶报告基因及其CRC稳定细胞株的构建；

步骤6：奥沙利铂影响CRC细胞HMGB1转录调控的基因片段、顺式作用元件和转录因子的鉴定；

步骤7：MAPKs和mTOR通路活性的检测；

步骤8：监测奥沙利铂治疗前、后临床患者血清中HMGB1蛋白浓度变化；

步骤9：统计学分析。

本发明中，优选的，步骤1包括以下步骤：

步骤1.1：细胞培养：CRC细胞柱HT29、HCT116、SW620常规培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并加入2ml谷氨酰胺，1％双抗(青霉素和链霉素的浓度均为100U/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中恒温培养，48～72h传代，实验细胞均为活力良好的对数生长期细胞；

步骤1.2：细胞转染：取对数生长期HCT116和SW620细胞，胰酶消化后接种于6孔板中，待细胞密度达到60％左右时，使用转染试剂Lipofectamine 2000将对照shRNA(sh-NC)、敲降HMGB1的shRNA(sh-HMGB1)对人结直肠癌细胞株HCT116和SW620进行转染，所有操作均严格遵守操作说明及流程进行；

步骤1.3：将转染后细胞板置于37℃、5％CO2培养箱中培养18～48小时，保证细胞的转染效率均达80％以上，用RT-qPCR法来检测mRNA水平，具体包括用TRIzol试剂提取各组细胞中总RNA，并使用紫外分光光度计检测RNA浓度，然后取1μg RNA样品逆转录制备cDNA，参照试剂盒说明书设置反应体系，进行RT-qPCR检测各样本中HMGB1 mRNA表达，(正向引物：5’-TATGGCAAAAGCGGACAAGG-3’，反向引物：5’-CTTCGCAACATCACCAATGGA-3’)，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法进行定量；

步骤1.4：采用蛋白凝胶印迹和免疫荧光共聚焦显微镜测定HMGB1表达，具体包括将细胞加入12孔板，细胞培养箱中培养24h，无血清饥饿处理3h后，加入35μM的奥沙利铂，37℃处理24h，随后使用4％多聚甲醛固定，0.1％Triton X-100通透，3％BSA封闭，加入预先稀释好的HMGB1抗体，并用Alexa Fluor 488或546耦联二抗检测，最后用共聚焦荧光显微镜观察分析。

本发明中，优选的，步骤2包括以下步骤：

步骤2.1：选择4～6周龄BALB/c nu/nu雌性裸鼠48只(分为6组，每组8只)，将肿瘤细胞悬液接种到裸鼠的背部皮下，每只裸鼠接种肿瘤细胞的细胞数为2x106；

步骤2.2：每三天用游标卡尺测量一次肿瘤大小，肿瘤大小按照以下公式计算：V＝LxW2/2，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤纵轴长度，W是肿瘤横轴长度；

步骤2.3：当肿瘤体积均值达到约130mm3，开始药物处理，给药方案如下：(1)对照组；(2)奥沙利铂给药组；(3)HMGB1给药组；(4)3-MA给药组；

(5)奥沙利铂和HMGB1联合给药组；(6)奥沙利铂和3-MA联合给药组；

步骤2.4：给药过程中按步骤2.2中的方法每三天测量肿瘤大小，除了检测肿瘤体积这一指标外，还检测肿瘤组织中的细胞自噬体；

步骤2.5：在所有给药过程结束，取出肿瘤组织并处死裸鼠，肿瘤组织切片后透射电子显微镜观察自噬体的形成情况。

本发明中，优选的，步骤3包括以下步骤：

步骤3.1：取对数生长期CRC细胞HT29和HCT116，预实验中选择的合适细胞数接种于60mm培养皿中；

步骤3.2：35μM oxaliplatin处理48h后，收集细胞，低速离心弃上清；

步骤3.3：细胞沉淀以2.5％的戊二醛溶液固定过夜，再以1％四氧化锇溶液处理，固定细胞2次；

步骤3.4：最后采用梯度乙醇溶液脱水后以环氧树脂812包埋细胞，制成100nm超薄切片，用饱和的醋酸铅和醋酸双氧铀溶液染色后，在透射电子显微镜下观察细胞自噬体的形成并摄片。

本发明中，优选的，步骤4包括以下步骤：

步骤4.1：取对数生长期CRC细胞HT29和HCT116，预实验中选择的合适细胞数接种于60mm培养皿中；

步骤4.2：35μM oxaliplatin处理48h后，撤去药物，分别于第1、2和4天后收集细胞，用不含EDTA Trypsin消化，收集在15ml离心管中离心后转移至流式管，lx BingingBuffer 100μl/Tube加入流式管中悬浮细胞，加入PI2.5，μl/Tube，FITC 2.5μl/Tube，室温放置10min；

步骤4.3：最后以400μl/Tube加入1x Binging Buffer，流式细胞仪上样检测。

本发明中，优选的，步骤5包括以下步骤：

步骤5.1：设计多个3’-端固定的HMGB1调控引物，以CRC细胞基因组DNA为模板，PCR扩增不同长度HMGB1调控基因(-83～+83、-383～+83、-688～+83、-975～+83、-1163～+83、-1327～+83、-1520～+83)，均将其连入pMD18-T载体，并转化宿主菌DH5a，氨苄青霉素筛选，阳性克隆并提取质粒，经KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序验证；

步骤5.2：正确的阳性克隆经KpnⅠ/HindⅢ双酶切后，连入pGL3-neo-luc报告基因的KpnⅠ/HindⅢ位点之间，构建含不同HMGB1调控基因的荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-luc质粒；

步骤5.3：同样-1520～+83HMGB1调控基因经XhoⅠ/HindⅢ双酶切后，连入pGL3-neo-luc报告基因的XhoⅠ/HindⅢ位点之间，构建出含-504～+83HMGB1的pGL3-HMGB1-luc质粒；

步骤5.4：转染不同pGL3-HMGB1-luc和pGL3-neo-luc报告基因质粒至CRC细胞，48h后加入终浓度600μg/ml的G418进行药物加压筛选20d，然后选取单个阳性克隆细胞。

本发明中，优选的，步骤6包括以下步骤：

步骤6.1：奥沙利铂耐药CRC细胞经固定、超声和染色体免疫共沉淀(ChIP)处理后获得纯化的DNA；

步骤6.2：通过特异性引物，RT-PCR扩增中心位点于-1103和-797处的HMGB1基因，寻找奥沙利铂富集在HMGB1的基因部位；

步骤6.3：应用生物信息学初步分析HMGB1-1163～-975区段的反式作用因子结合位点，对其启动子区域顺式作用元件实施缺失突变，寻找奥沙利铂影响CRC细胞HMGB1基因转录的关键转录因子。

本发明中，优选的，步骤7具体包括奥沙利铂处理细胞后，收集细胞并提取总蛋白，分别使用抗ERK1/2、phospho-ERK1/2；p38、phospho-p38；JNK、phospho-JNK；mTOR、phospho-mTOR(ser2481)；S6K、phospho-S6K；4E-BP1、phospho-4E-BP1；Beclin1/2和phospho-Beclin1/2的单克隆抗体，采用western blot的方法，检测蛋白的磷酸化来反应通路的激活或抑制。

本发明中，优选的，步骤8包括以下步骤：

步骤8.1：临床确诊为CRC患者100例纳入研究对象，分别于奥沙利铂化疗前后清晨空腹抽新鲜静脉血2ml，离心分离血清，-20℃冰箱保存备用；

步骤8.2：检测过程严格照试剂盒说明书操作：采用双抗体夹心法检测，用TMB显色，酶标仪在波长450nm处检测OD值，用CurveExpert软件分析，得到标准曲线的直线回归方程式，进而求得血清HMGB1的实际浓度。

本发明中，优选的，步骤9具体为采用GraphPad Prism 6.0或IBM SPSS 22软件包进行数据分析,数据结果以均数±标准差(Mean±SD)表示，两组之间均数比较采用两样本t检验，三组及以上均数比较采用ANOVA分析，检验水准P﹤0.05。

本发明的工作原理及使用流程：使用时，首先准备研究材料，人结直肠癌细胞株HT29、HCT116、SW620，奥沙利铂和自噬抑制剂3-MA，HMGB1蛋白，核酸提取试剂盒和Western试剂盒，LC3I/II抗体，p62抗体，转染试剂Lipofectamine 2000，逆转录试剂盒，MTT试剂盒购，RPMI-1640培养基及胎牛血清，Annexin-V-FITC/PI凋亡检测试剂盒，然后将CRC细胞柱HT29、HCT116、SW620常规培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并加入2ml谷氨酰胺，1％双抗(青霉素和链霉素的浓度均为100U/ml)，置于37℃、5％CO2培养箱中恒温培养，48～72h传代，实验细胞均为活力良好的对数生长期细胞，取对数生长期HCT116和SW620细胞，胰酶消化后接种于6孔板中，待细胞密度达到60％左右时，使用转染试剂Lipofectamine2000将对照shRNA(sh-NC)、敲降HMGB1的shRNA(sh-HMGB1)对人结直肠癌细胞株HCT116和SW620进行转染，所有操作均严格遵守操作说明及流程进行；将转染后细胞板置于37℃、5％CO2培养箱中培养18～48小时，保证细胞的转染效率均达80％以上，用RT-qPCR法来检测mRNA水平，具体包括用TRIzol试剂提取各组细胞中总RNA，并使用紫外分光光度计检测RNA浓度，然后取1μg RNA样品逆转录制备cDNA，参照试剂盒说明书设置反应体系，进行RT-qPCR检测各样本中HMGB1 mRNA表达，(正向引物：5’-TATGGCAAAAGCGGACAAGG-3’，反向引物：5’-CTTCGCAACATCACCAATGGA-3’)，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法进行定量；并且采用蛋白凝胶印迹和免疫荧光共聚焦显微镜测定HMGB1表达，具体包括将细胞加入12孔板，细胞培养箱中培养24h，无血清饥饿处理3h后，加入35μM的奥沙利铂，37℃处理24h，随后使用4％多聚甲醛固定，0.1％Triton X-100通透，3％BSA封闭，加入预先稀释好的HMGB1抗体，并用AlexaFluor 488或546耦联二抗检测，最后用共聚焦荧光显微镜观察分析，分别从mRNA水平和蛋白水平检测HMGB1的表达；然后建立鼠人CRC细胞移植瘤模型，选择4～6周龄BALB/c nu/nu雌性裸鼠48只(分为6组，每组8只)，将肿瘤细胞悬液接种到裸鼠的背部皮下，每只裸鼠接种肿瘤细胞的细胞数为2x106；每三天用游标卡尺测量一次肿瘤大小，肿瘤大小按照以下公式计算：V＝LxW2/2，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤纵轴长度，W是肿瘤横轴长度；当肿瘤体积均值达到约130mm3，开始药物处理，给药方案如下：(1)对照组；(2)奥沙利铂给药组；(3)HMGB1给药组；(4)3-MA给药组；(5)奥沙利铂和HMGB1联合给药组；(6)奥沙利铂和3-MA联合给药组，给药过程中的方法每三天测量肿瘤大小，除了检测肿瘤体积这一指标外，还检测肿瘤组织中的细胞自噬体；在所有给药过程结束，取出肿瘤组织并处死裸鼠，肿瘤组织切片后透射电子显微镜观察自噬体的形成情况；然后取对数生长期CRC细胞HT29和HCT116，预实验中选择的合适细胞数接种于60mm培养皿中，35μM oxaliplatin处理48h后，收集细胞，低速离心弃上清，细胞沉淀以2.5％的戊二醛溶液固定过夜，再以1％四氧化锇溶液处理，固定细胞2次，最后采用梯度乙醇溶液脱水后以环氧树脂812包埋细胞，制成100nm超薄切片，用饱和的醋酸铅和醋酸双氧铀溶液染色后，在透射电子显微镜下观察细胞自噬体的形成并摄片，再取对数生长期CRC细胞HT29和HCT116，预实验中选择的合适细胞数接种于60mm培养皿中，35μMoxaliplatin处理48h后，撤去药物，分别于第1、2和4天后收集细胞，用不含EDTA Trypsin消化，收集在15ml离心管中离心后转移至流式管，lx Binging Buffer 100μl/Tube加入流式管中悬浮细胞，加入PI2.5，μl/Tube，FITC 2.5μl/Tube，室温放置10min，最后以400μl/Tube加入1x Binging Buffer，流式细胞仪上样检测，然后设计多个3’-端固定的HMGB1调控引物，以CRC细胞基因组DNA为模板，PCR扩增不同长度HMGB1调控基因(-83～+83、-383～+83、-688～+83、-975～+83、-1163～+83、-1327～+83、-1520～+83，)均将其连入pMD18-T载体，并转化宿主菌DH5a，氨苄青霉素筛选，阳性克隆并提取质粒，经KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序验证，正确的阳性克隆经KpnⅠ/HindⅢ双酶切后，连入pGL3-neo-luc报告基因的KpnⅠ/HindⅢ位点之间，构建含不同HMGB1调控基因的荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-luc质粒，同样-1520～+83HMGB1调控基因经XhoⅠ/HindⅢ双酶切后，连入pGL3-neo-luc报告基因的XhoⅠ/HindⅢ位点之间，构建出含-504～+83HMGB1的pGL3-HMGB1-luc质粒，转染不同pGL3-HMGB1-luc和pGL3-neo-luc报告基因质粒至CRC细胞，48h后加入终浓度600μg/ml的G418进行药物加压筛选20d，然后选取单个阳性克隆细胞；奥沙利铂耐药CRC细胞经固定、超声和染色体免疫共沉淀(ChIP)处理后获得纯化的DNA，通过特异性引物，RT-PCR扩增中心位点于-1103和-797处的HMGB1基因，寻找奥沙利铂富集在HMGB1的基因部位，应用生物信息学初步分析HMGB1-1163～-975区段的反式作用因子结合位点，对其启动子区域顺式作用元件实施缺失突变，寻找奥沙利铂影响CRC细胞HMGB1基因转录的关键转录因子，然后进行MAPKs和mTOR通路活性的检测，奥沙利铂处理细胞后，收集细胞并提取总蛋白，分别使用抗ERK1/2、phospho-ERK1/2；p38、phospho-p38；JNK、phospho-JNK；mTOR、phospho-mTOR(ser2481)；S6K、phospho-S6K；4E-BP1、phospho-4E-BP1；Beclin1/2和phospho-Beclin1/2的单克隆抗体，采用western blot的方法，检测蛋白的磷酸化来反应通路的激活或抑制，最后临床确诊为CRC患者100例纳入研究对象，分别于奥沙利铂化疗前后清晨空腹抽新鲜静脉血2ml，离心分离血清，-20℃冰箱保存备用，检测过程严格照试剂盒说明书操作：采用双抗体夹心法检测，用TMB显色，酶标仪在波长450nm处检测OD值，用CurveExpert软件分析，得到标准曲线的直线回归方程式，进而求得血清HMGB1的实际浓度，研究过程中，采用GraphPadPrism 6.0或IBM SPSS 22软件包进行数据分析,数据结果以均数±标准差(Mean±SD)表示，两组之间均数比较采用两样本t检验，三组及以上均数比较采用ANOVA分析，检验水准P﹤0.05，实验结果如图2、图3、图4、图8和图9所示，随着奥沙利铂浓度增加，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化增加，而p62表达水平显著下调，与奥沙利铂单独处理组相比，奥沙利铂联合3-MA处理组HT29和HCT116细胞增殖活性显著降低，凋亡显著增加，该结果表明，奥沙利铂诱导CRC细胞发生了自噬反应，阻断自噬后奥沙利铂敏感性增强。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。