内源性HMGB1介导的自噬反应对白血病细胞化疗敏感性的影响及机制研究

摘要

急性白血病(acuteleukemia，AL)是儿童及青少年时期最常见的恶性肿瘤，化疗是其主要的治疗手段，而化疗敏感性降低及耐药产生所致的化疗失败和复发是白血病治疗中面临的主要困难。近年来学术界普遍认为，白血病耐药是多因素、多种机制共同作用的结果，但具体机制尚不明确。因此，揭示白血病发病及耐药的作用机制，寻找新的治疗干预靶点，对于提高白血病患儿的长期无事件生存率（event-freesurvival，EFS）具有非常重要的意义。高迁移率族蛋白B1(highmobilitygroupbox1protein，HMGB1)是一种保守的非组蛋白核蛋白，在稳定染色质的结构与功能及基因转录调控中起着重要作用。本项目组前期研究发现，外源性HMGB1通过自噬介导了白血病细胞化疗耐药的形成，目前尚不清楚内源性HMGB1能否通过自噬影响白血病细胞的化疗敏感性。
　　 本研究首先收集了AL患儿的骨髓单个核细胞(bonemarrowmononuclearcells，BMMCs)和多种细胞株，通过反转录PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)和蛋白印迹方法(westernblotting)方法分别对30例急性淋巴细胞性白血病(acutelymphoblasticleukemia，ALL)患儿、11例急性非淋巴细胞性白血病(acutenon-lymphocyticleukemia,ANLL)患儿和不同细胞株中内源性HMGB1的表达进行了检测，发现初治及复发期的HMGB1mRNA相对表达水平明显高于缓解期。同时，通过对多种细胞株的mRNA和蛋白分析发现，HMGB1在白血病细胞株（K562，HL-60和Jurkat）和其它多种实体瘤细胞中的表达较非肿瘤细胞显著增高，表明内源性HMGB1可能参与了儿童AL的发病，且HMGB1的表达水平与AL的病程相关。进一步探讨了内源性HMGB1对白血病细胞化疗敏感性的影响。以Jurkat和K562细胞为研究对象，通过基因转染、RNA干扰（RNAinterference，RNAi）技术和westernblotting、四甲基偶氮唑蓝(methylthiazolyltertrazolium，MTT)染色实验等方法，发现下调HMGB1表达能明显增强白血病细胞的化疗敏感性;相反，上调HMGB1表达降低了白血病细胞的化疗敏感性。
　　 其次，本研究发现内源性HMGB1能够通过介导细胞自噬的发生影响白血病细胞的化疗敏感性。不同的药物处理K562细胞后，westernblotting检测发现化疗药物能明显增加细胞微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associatedprotein1lightchain3，LC3)-Ⅱ的表达水平，且与Hank's平衡盐溶液（Hank'sbalancedsaltsolution，HBSS）饥饿诱导相比无明显统计学差异（P＞0.05）。进一步以HBSS诱导自噬为研究模型，通过基因转染、RNAi技术和westernblotting、透射电镜等实验方法，发现上调HMGB1表达能显著增加LC3-Ⅱ、Beclin1表达和自噬泡的形成;相反，下调HMGB1表达能够降低LC3-Ⅱ和Beclin1表达和自噬泡的形成;且HMGB1基因沉默的白血病细胞予以溶酶体酶抑制剂(PA/E64D)干预后，并不能增加细胞中LC3-Ⅱ的表达，表明HMGB1上调的自噬反应并不是由于溶酶体被抑制后LC3-Ⅱ消耗减少所致，而是由HMBG1本身所触发的自噬潮（autophagyflux）产生。同时，自噬抑制剂6-氨基-3-甲基嘌呤（3-methyladenine，3-MA）干预后能明显抑制LC3-Ⅱ和自噬体的表达，通过MTT实验发现转染HMGB1基因的白血病细胞经3-MA预处理后能明显增强其化疗敏感性，提示HMGB1通过调节自噬对白血病细胞的化疗敏感性起着重要的作用。
　　 最后，阐明了磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B（proteinkinaseB，Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)信号途径可能是HMGB1调节白血病细胞自噬的主要途径之一。通过对白血病细胞HMGB1基因转染及RNAi，发现增加HMGB1基因表达后能显著抑制Akt以及mTOR下游p70S6K蛋白的磷酸化水平;相反，抑制HMGB1表达后进一步激活了Akt磷酸化，且能逆转饥饿诱导下mTOR/raptor复合物之间的相互作用。进一步研究发现，抑制Akt上游PI3K-Ⅰ基因后，下调HMGB1表达不能降低饥饿诱导下LC3-Ⅱ的表达水平，证实HMGB1是PI3K-Ⅰ上游调控因子.
　　 综上所述，内源性HMGB1参与了儿童AL的发病及对化疗敏感性的影响，HMGB1可以介导自噬的发生影响白血病细胞的化疗敏感性，PI3K/Akt/mTOR信号途径可能为其中主要的作用机制之一。本研究揭示HMGB1通过调控自噬影响儿童急性白血病化疗敏感性的作用机制，为寻找白血病的治疗提供了线索和科学依据。

目录

声明

摘要

英文缩写注释

前言

第一章 HMGB1在急性白血病患儿及白血病细胞株中的表达及对化疗敏感性的影响

1 对象与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二章 HMGB1介导白血病细胞自噬对化疗敏感性的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第三章 HMGB1调控白血病细胞自噬分子机制的研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

总结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间主要成果