液相色谱-高分辨质谱快速测定奶粉中氯丙醇酯含量的方法

摘要

本发明公开了液相色谱‑高分辨质谱快速测定奶粉中氯丙醇酯含量的方法，所述氯丙醇酯包括两种缩水甘油酯、两种氯丙醇单酯和三种氯丙醇双酯；所述方法采用两级提取法，第一级采用甲醇振荡提取、C18固相萃取柱净化，完成对缩水甘油酯和部分氯丙醇单酯的提取和净化工作，第二级采用二氯甲烷、甲醇体积比8:2的混合溶剂提取，中性氧化铝粉净化，去除油脂干扰的同时，可完成对氯丙醇双酯的提取与净化，合并第一、二级提取液，用高效液相色谱‑高分辨质谱联用仪检测，采用外标法定量，即可实现对奶粉中氯丙醇酯的高通量筛查，方法检出限为0.02mg/kg，定量限为0.05mg/kg，回收率≥80.6％，标准偏差低于10％，该方法对高蛋白、高脂肪的奶粉基质具有较强的适用性。

说明书

技术领域

本发明涉及液相色谱-高分辨质谱快速测定奶粉中氯丙醇酯含量的方法。

背景技术

氯丙醇酯，是近年来发现的存在于婴幼儿配方奶粉中的一类新型污染物，其水解产物氯丙醇被证实具有致癌性、遗传毒性、肾脏毒性等。目前，食品中氯丙醇酯的检测对象主要集中在食用油中，常见的前处理技术包括：固相萃取、基质分散固相萃取、直接溶剂萃取、超声辅助提取等，主要目标是在保证氯丙醇酯类化合物高提取率的前提下，有效去除食用油中存在的高含量油脂—甘油三酯等非极性化合物的干扰，此类化合物在后续质谱分析中会产生强烈的离子化抑制效应，导致本就低含量的氯丙醇酯含量测定结果产生偏差或者未能检出，目前对于食用油中氯丙醇酯的研究己经在测定方法、形成机理、毒性研究及控制方法等方面取得了一定的进展。

但目前，关于婴幼儿配方奶粉中氯丙醇酯的相关研究还不够深入，尤其是针对复杂奶粉基质中目标化合物的提取净化方法尚未见报道。奶粉基质种类众多，成分复杂，除了添加量为20％左右的油脂外，其他添加的营养类化合物种类极其丰富，除此之外，一些有毒有害的化合物也会在奶粉中存在，包括：微生物、真菌毒素-黄曲霉毒素以及奶粉基质中残留的农兽药等。因此，建立全面高效的前处理方法，是保证获取全面氯丙醇酯结构信息的重要前提。如何通过一次前处理，实现婴幼儿奶粉中氯丙醇酯的提取、净化工作，这是一个巨大的挑战。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种利用液相色谱-高分辨质谱快速测定奶粉中氯丙醇酯含量的方法。

本发明采用的技术方案是：

液相色谱-高分辨质谱快速测定奶粉中氯丙醇酯含量的方法，所述氯丙醇酯为缩水甘油-棕榈酸酯、缩水甘油-硬脂酸酯、3-氯丙醇-2-硬脂酸单酯、3-氯丙醇-1-棕榈酸单酯、3-氯丙醇-1,2-棕榈酸二酯、2-氯丙醇-1,3-硬脂酸二酯、3-氯丙醇-1-棕榈酸-2-硬脂酸二酯中的一种或多种；所述方法包括以下步骤：

(A)样品前处理

(1)从奶粉样品中提取脂肪样品，脂肪样品用甲醇提取，离心，得到有机相A及残渣A；

(2)取步骤(1)的有机相A经C18固相萃取柱净化，甲醇淋洗，二氯甲烷和甲醇的体积比8:2的混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱，所得洗脱液经氮吹浓缩近干，加入甲醇溶液复溶；

(3)取步骤(1)的残渣A加入二氯甲烷和甲醇的体积比8:2的混合溶剂进行二次提取，离心，得到有机相B及残渣B；

(4)取步骤(3)的有机相B，氮吹浓缩近干，加入甲醇溶液复溶，加入中性氧化铝粉充分震荡后离心，得到上清液C及沉淀C；

(5)合并步骤(2)的甲醇溶液和步骤(4)的上清液C，氮吹浓缩，甲醇定容至2.0mL，滤膜过滤，得到供试品溶液；

(B)高效液相色谱-高分辨质谱检测

供试品溶液用高效液相色谱-高分辨质谱联用仪检测，采用外标法定量，得到奶粉中7种氯丙醇酯含量。

所述步骤(1)中，所述从奶粉样品中提取脂肪样品，按照GB 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》中的方法三中的步骤17.1.2、步骤17.2、步骤17.3进行。

进一步，所述步骤(1)中，甲醇的体积用量以脂肪样品的质量计为8～20mL/g，优选10mL/g。

所述步骤(1)中，提取一般是震荡5～10min，超声提取20～30min。

所述步骤(1)中，离心一般12000～15000r/min转速下离心。

所述步骤(2)中，C18固相萃取柱使用前依次采用甲醇、水进行活化。

所述步骤(2)中，有机相A上样后通常平衡5min。

所述步骤(2)中，洗脱剂的体积一般为2个柱体积。

所述步骤(2)中，用来复溶的甲醇溶液的体积用量以脂肪样品的质量计为1～3mL/g，优选2mL/g。

所述步骤(3)中，二氯甲烷和甲醇的体积比8:2的混合溶剂的体积用量以脂肪样品的的质量计为8～20mL/g，优选10mL/g。

所述步骤(3)中，二次提取一般是震荡5～10min，超声提取20～30min。

所述步骤(3)中，离心一般12000～15000r/min转速下离心。

所述步骤(4)中，用来复溶的甲醇溶液的体积用量以脂肪样品的质量计为1～3mL/g，优选2mL/g。

所述步骤(4)中，中性氧化铝粉的用量与脂肪样品的质量比为0.5～1：1，优选0.5:1。

所述中性氧化铝粉末粒度优选100-200目。

所述步骤(5)中，滤膜为0.22μm滤膜。

进一步，所述步骤(1)的样品前处理优选按以下步骤进行：

(1)5.0g奶粉样品提取脂肪样品，所得脂肪样品加入10mL甲醇溶液震荡5min，超声提取20min，以12000r/min高速离心，得到有机相A及残渣A；(2)取上层有机相A经C18固相萃取柱净化，平衡5min，甲醇淋洗，用12mL的二氯甲烷和甲醇的体积比8:2的混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱，所得洗脱液经氮吹浓缩近干，加入2.0mL甲醇溶液复溶；(3)残渣A加入10mL二氯甲烷和甲醇的体积比8:2的混合溶剂进行二次提取，震荡5min，超声提取20min，以12000r/min高速离心，得到有机相B及残渣B；(4)取上层有机相B，氮吹浓缩近干，加入2.0mL甲醇溶液复溶，加入0.5g中性氧化铝粉充分震荡，以12000r/min高速离心，得到上清液C及沉淀C；(5)合并(2)中的2.0mL甲醇溶液和(4)中的上清液C，氮吹浓缩，甲醇定容至2.0mL，过0.22μm滤膜，得供试品溶液待分析。

进一步，所述步骤(B)中采用高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪。

进一步，所述步骤(B)中，高效液相色谱的条件为：

C18色谱柱，流动相A：0.02mM乙酸钠的甲醇-水溶液，其中甲醇、水的体积比为9:1；流动相B：0.02mM乙酸钠的异丙醇-甲醇溶液，其中异丙醇、甲醇的体积比为1:1；梯度洗脱。

进一步，液相色谱的流速:0.3mL/min，进样量:5.0μL。

进一步，液相色谱的梯度洗脱程序见表1

表1梯度洗脱程序

所述步骤(B)中，高分辨质谱的条件为：

质谱条件：在正/负离子转换模式下进行全扫描测定，质量范围：m/z 100～1000，负离子模式2800V，正离子模式3500V，离子传输管温度为320℃，鞘气(N

所述步骤(B)中，外标法定量的操作步骤为：将供试品溶液用液相色谱-高分辨质谱联用仪进行检测，得到供试品溶液的提取离子流色谱图，供试品溶液的各待测成分的的峰面积与与其对应的标准品的标准曲线比较，计算得到供试品溶液中各待测成分的浓度，相应换算得到脂肪样品中各待测成分的含量，再换算得到奶粉样品中各待测成分的含量。

标准品的标准曲线按以下方法得到：将氯丙醇酯为缩水甘油-棕榈酸酯、缩水甘油-硬脂酸酯、3-氯丙醇-2-硬脂酸单酯、3-氯丙醇-1-棕榈酸单酯、3-氯丙醇-1,2-棕榈酸二酯、2-氯丙醇-1,3-硬脂酸二酯、3-氯丙醇-1-棕榈酸-2-硬脂酸二酯的标准品配制成不同浓度的标准工作液，按照步骤(B)用液相色谱-高分辨质谱联用仪在相同条件下进行检测，按照标准品的浓度和对应标准品的提取离子流色谱图的峰面积，绘制得到标准曲线。

本发明的前处理为两级提取净化，第一级采用甲醇振荡提取、C18固相萃取柱净化，可完成对缩水甘油酯和部分氯丙醇单酯的提取和净化工作，第二级采用甲醇提取，二氯甲烷辅助提取，中性氧化铝粉净化，去除油脂干扰的同时，可完成对氯丙醇双酯的提取与净化，通过合并第一、二级提取液，可以同时保证对偏极性和中等极性的缩水甘油酯(缩水甘油-棕榈酸酯，缩水甘油-硬脂酸酯)和氯丙醇单酯(3-氯丙醇-2-硬脂酸单酯和3-氯丙醇-1-棕榈酸单酯)以及对低极性氯丙醇双酯的提取率，同时避免对其他脂肪成分的过度提取。

本发明通过高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(HPLC-Q-Orbitrap-HRMS)技术对二级提取液进行定性和定量，可实现对奶粉中氯丙醇酯的高通量筛查，方法检出限为0.02mg/kg，定量限为0.05mg/kg，回收率≥80.6％，标准偏差低于10％，该方法对高蛋白、高脂肪的奶粉基质具有较强的适用性。本发明首次提出对奶粉中氯丙醇酯的高通量筛查方法，便于针对奶粉中氯丙醇酯的含量进行监管。

附图说明

图1 7种氯丙醇酯标准品结构式，图1中，A图为缩水甘油酯结构式；B图为氯丙醇单酯结构式；C图为氯丙醇双酯结构式。

图2 7种氯丙醇酯标准品及其3种同位素内标的提取离子色谱图，图2中，a：缩水甘油-棕榈酸酯，b：缩水甘油-硬脂酸酯，c：3-氯丙醇-1-棕榈酸单酯，d：3-氯丙醇-2-硬脂酸单酯，e：3-氯丙醇-1,2-棕榈酸二酯，f：-氯丙醇-1-棕榈酸-2-硬脂酸二酯，g：2-氯丙醇-1,3-硬脂酸二酯，h：D5-缩水甘油-棕榈酸酯，i：D5-3-氯丙醇-2-硬脂酸单酯，j：D5-3-氯丙醇-1,2-棕榈酸二酯。

图3不同二氯甲烷比例下，7种代表性氯丙醇酯在两种奶粉的脂肪样本中的加标回收率，图3中，A图为婴幼儿配方奶粉，B图为特殊医学用途配方奶粉。

图4 7种代表性氯丙醇酯和棕榈酸甘油三酯在不同洗脱体积下的洗脱曲线图。

图5中性氧化铝粉末对5.0g两种奶粉的除油率，以及7种代表性氯丙醇酯经过中性氧化铝粉末净化后的的回收率曲线图(n＝3，％)，图5中，A曲线为婴幼儿配方奶粉除油率，B曲线为特殊医学用途配方奶粉除油率。

具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

仪器与试剂

Q-Exactive四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(赛默飞世尔科技ThermoFisherScientific公司)，配置有H-ESI II源。液相色谱系统为UltiMate3000高压液相色谱带自动进样器。Milli-Q高纯水发生器(美国Millipore公司)，冷冻离心机(德国SIGMA公司)，漩涡振动器(德国Heldolph公司)，滤膜(DIKMA,PTFE 0.22μm)，C18固相萃取柱(美国WATERS公司，150mg/6cc)。

氯丙醇酯标准品购自加拿大Toronto Research Chemicals公司和日本Tsukishima Foods Industry公司，纯度≥95％。包括：(A)缩水甘油酯：1缩水甘油-棕榈酸酯(Glycidol palmitate)，2缩水甘油-硬脂酸酯(Glycidol stearate)；(B)氯丙醇单酯：33-氯丙醇-2-硬脂酸单酯(2-stearate-3-chloropropanediol)和43-氯丙醇-1-棕榈酸单酯(1-palmitate-3-chloropropanediol)；(C)氯丙醇双酯：53-氯丙醇-1,2-棕榈酸二酯(1,2-bis-palmitate-3-chloropropanediol)，62-氯丙醇-1,3-硬脂酸二酯(1,3-bis-stearate-2-chloropropanediol)和73-氯丙醇-1-棕榈酸-2-硬脂酸二酯(1-palmitate-2-stearate-3-chloropropanediol)，及对应同位素内标D5-3-氯丙醇-1,2-棕榈酸二酯(D5-1,2-bis-palmitate-3-chloropropanediol)、D5-3-氯丙醇-2-硬脂酸单酯(D5-2-stearate-3-chloropropanediol)、D5-缩水甘油-棕榈酸酯(D5-Glycidol palmitate)。标准品结构式见图1。

将分别称取上述适量标准品，用二氯甲烷溶解，甲醇(含0.02mM乙酸钠)定容，配制成1.0mg/mL的标准储备溶液，-20℃避光保存。乙酸钠(色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司)，甲醇，二氯甲烷和乙腈等其他试剂均为色谱纯，采购于德国Merck公司，实验用水为Milli-Q超纯水(18.2ΩM.cm)。

色谱及质谱条件

液相条件：Syncronis C18(2.1mm x 150mm,1.7μm)为固定相，流动相A：甲醇-水(9:1,V:V，含0.02mM乙酸钠)，流动相B：异丙醇-甲醇(1:1,V:V，含0.02mM乙酸钠)溶液，流速:0.3mL/min，进样量:5.0μL。梯度如表1所示。

表1在ESI

质谱条件：质谱在正/负离子转换模式下进行全扫描测定，质量范围：m/z100～1000(周期时长256ms)，分辨率70,000(m/z 200)，自动增益控制(AGC)目标值5e

样品前处理流程

奶粉基质涵盖了：婴幼儿配方奶粉、调制乳粉、特殊医学用途配方奶粉，包括全营养配方，氨基酸配方，深度水解配方等，品牌覆盖国内外常见奶粉生产公司。实验参考GB5009.6-2016《食品中脂肪的测定》方法三中的步骤17.1.2、步骤17.2、步骤17.3，取5.0g奶粉样品，提取的脂肪约为1g，准确称量，然后在提取出的脂肪样品中加入内标，再进行前处理的做法。

前处理步骤如下：(1)5.0g奶粉样品提取的脂肪样品中，加入10mL甲醇溶液震荡5min，超声提取20min，以12000r/min高速离心，得到有机相A及残渣A；(2)取上层有机相A经C18净化柱净化，平衡5min，甲醇淋洗，12mL的80％的二氯甲烷-甲醇(V:V)作为洗脱剂进行洗脱，所得洗脱液经氮吹浓缩近干，加入2.0mL甲醇溶液复溶；(3)残渣A加入10mL80％的二氯甲烷-甲醇溶液(V:V)进行二次提取，震荡5min，超声提取20min，以12000r/min高速离心，得到有机相B及残渣B；(4)取上层有机相B，氮吹浓缩近干，加入2.0mL甲醇溶液复溶，加入0.5g中性氧化铝粉(100～200目)充分震荡，以12000r/min高速离心，得到上清液C及沉淀C；(5)合并(2)中的2.0mL甲醇溶液和(4)中的上清液C，氮吹浓缩，甲醇定容至2.0mL，过0.22μm滤膜，得供试品溶液待分析。所有实验均为3平行处理，实验数据采用平均值±SD表示。

定性、定量分析

定性分析：利用高通量筛查软件Exactfinder

定量分析：配制7种氯丙醇酯标准品的混合标准溶液(1.0μg/mL)，并逐级稀释工作溶液，其浓度范围为10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL。以浓度为横坐标，标准品峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，作为目标物定量的依据。

将供试品溶液用液相色谱-高分辨质谱联用仪在相同条件下进行检测，得到供试品溶液的提取离子流色谱图，供试品溶液的各待测成分的的峰面积与与其对应的标准品的标准曲线比较，计算得到供试品溶液中各待测成分的浓度，相应换算得到待测脂肪样品中各待测成分的含量，再换算得到奶粉样品中各待测成分的含量。

结果与讨论

提取溶剂的选择

目前食用油中关于氯丙醇酯类化合物的提取，多采用正己烷、乙醚、二氯甲烷、乙腈、甲醇的单一有机试剂或二元、三元混合溶液作为提取溶剂。实验分别选择了乙腈、甲醇，正己烷、乙醚和二氯甲烷作为提取溶剂来提取奶粉样品中提取出来的脂肪样品，5.0g奶粉样品提取出来的脂肪样品中，提取溶剂的用量为10mL，提取一次。脂肪样品按以下方法获得：通过预实验，挑选阴性的婴幼儿配方奶粉和特殊医学用途配方奶粉作为空白基质，参考GB 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》方法，在提取出的脂肪中加入不同种类的代表性氯丙醇酯——缩水甘油酯(缩水甘油-棕榈酸酯，缩水甘油-硬脂酸酯)；氯丙醇单酯(3-氯丙醇-2-硬脂酸单酯和3-氯丙醇-1-棕榈酸单酯)；和氯丙醇双酯(3-氯丙醇-1,2-棕榈酸二酯，2-氯丙醇-1,3-硬脂酸二酯和3-氯丙醇-1-棕榈酸-2-硬脂酸二酯)作为内标，针对提取溶剂进行方法学验证，通过考察峰面积值来计算的回收率。

不同提取溶剂下，7种代表性氯丙醇酯类化合物在婴幼儿配方奶粉和特殊医学用途配方奶粉中的回收率如表2所示，结果表明，采用乙腈和甲醇作为提取溶剂，峰形好且干扰较少，对偏极性和中等极性的缩水甘油酯(缩水甘油-棕榈酸酯，缩水甘油-硬脂酸酯)和氯丙醇单酯(3-氯丙醇-2-硬脂酸单酯和3-氯丙醇-1-棕榈酸单酯)提取效果佳，但是对低极性氯丙醇双酯(3-氯丙醇-1,2-棕榈酸二酯，2-氯丙醇-1,3-硬脂酸二酯和3-氯丙醇-1-棕榈酸-2-硬脂酸二酯)的提取效果不理想。用正己烷，乙醚和二氯甲烷作为提取溶剂，除了对低极性氯丙醇双酯的提取效果得到改善外，对其余化合物提取效果均不如乙腈和甲醇提取液。另外，通过测量正己烷、乙醚和二氯甲烷提取液中的残余油脂值，可得知正己烷和乙醚相较于二氯甲烷油脂干扰严重。因此，为了同时满足上述不同理化性质的常见3大类氯丙醇酯类化合物的提取需求，本发明采用分级提取净化体系。首先，选择溶解性好、渗透性更强的甲醇溶液作为第一级提取溶剂，在确保偏极性和中等极性的缩水甘油酯和氯丙醇单酯提取效率的同时，还可起到沉淀蛋白质降低干扰的作用；然后，考虑到二氯甲烷作为提取溶剂油脂干扰小且与甲醇互溶性强，第二级采用二氯甲烷作为辅助提取溶剂，并加入适量甲醇，在确保低极性氯丙醇双酯提取率的同时，还可避免二氯甲烷直接萃取导致的甘油三酯、甘油二酯等油脂成分被过度提取。因此，最终确认提取溶剂依次为甲醇溶液和甲醇-二氯甲烷溶液。两组溶剂的极性覆盖范围广，完全满足三大类氯丙醇酯类化合物的提取需求。

表2不同提取液下，7种代表性氯丙醇酯类化合物在婴幼儿配方奶粉和特殊医学用途配方奶粉中的回收率(n＝6，％)

P:棕榈酸,S:硬脂酸,MCPD:氯丙醇；

A:婴幼儿配方奶粉,B:特殊医学用途配方奶粉.

二氯甲烷比例优化

二氯甲烷作为二级提取溶剂，其所占比例对氯丙醇酯类化合物，尤其是低极性氯丙醇双酯类化合物的提取效率有很大影响。实验中分别考察了进行二级提取时，二氯甲烷在二氯甲烷、甲醇混合溶剂的体积占比为30％，50％，80％和100％时的上述7种代表性氯丙醇酯加标回收率情况。不同二氯甲烷比例下，7种代表性氯丙醇酯的加标回收率如图3所示，图3中，A图为在婴幼儿配方奶粉，B图为特殊医学用途配方奶粉，(n＝6，％)。

图3结果表明，偏极性的缩水甘油酯(缩水甘油-棕榈酸酯，缩水甘油-硬脂酸酯)和中等极性氯丙醇单酯(3-氯丙醇-2-硬脂酸单酯和3-氯丙醇-1-棕榈酸单酯)主要存在甲醇提取液中，受二氯甲烷比值影响不大，该类化合物回收率稳定维持在70％以上。然而，低极性氯丙醇双酯(3-氯丙醇-1,2-棕榈酸二酯，2-氯丙醇-1,3-硬脂酸二酯和3-氯丙醇-1-棕榈酸-2-硬脂酸二酯)的回收率受二氯甲烷所占比值的影响很大，当二氯甲烷占比为30％和50％时，提取效率较差，回收率均小于50％；当二氯甲烷占比为80％和100％时，提取率逐渐趋于稳定，回收率数值均达到70％以上。考虑到脂肪基质中甘油三酯等油脂成分的影响，最终确定二级提取液中二氯甲烷所占比值为80％。从图3可知，7种代表性氯丙醇酯在婴幼儿配方奶粉(图3A)和特殊医学用途配方奶粉(图3B)中的回收率均平稳地保持在70％以上。

净化条件的选择

脂肪样品首先经过第一级提取液-甲醇进行提取，提取目标化合物主要包括偏极性和中等极性的缩水甘油酯(缩水甘油-棕榈酸酯，缩水甘油-硬脂酸酯)和氯丙醇单酯(3-氯丙醇-2-硬脂酸单酯和3-氯丙醇-1-棕榈酸单酯)等，以及少量的低极性氯丙醇双酯(3-氯丙醇-1,2-棕榈酸二酯，2-氯丙醇-1,3-硬脂酸二酯和3-氯丙醇-1-棕榈酸-2-硬脂酸二酯)等。此外，不可避免的甲醇提取溶液中会存在一定的杂质干扰，包括脂溶性维生素和真菌毒素等，这些小分子化合物采用C18固相萃取小柱可有效将其去除。实验中针对C18净化柱的淋洗、洗脱条件进行了详细优化，实验过程如下：取上述7种代表性氯丙醇酯类化合物的混合标准溶液10μL(C＝1.0mg/mL)，甲醇定容至10mL，采用的是C18固相萃取柱(美国WATERS公司，填料量150mg，柱体积6cc，每根C18净化柱使用前依次采用甲醇、水进行活化，上样后平衡5min，分别采用12mL的0％，10％，20％，30％，50％，80％和100％的二氯甲烷-甲醇(V:V)溶液进行洗脱，收集洗脱液，氮吹浓缩后，甲醇定容至2.0mL，经PTFE滤膜过滤后，LC-MS测定。C18净化柱在不同洗脱条件下，7种代表性氯丙醇酯类化合物的回收率如表3所示(n＝6，％)

结果表明：0％的二氯甲烷-甲醇(V:V)洗脱液中，未检测到目标化合物；10％，20％，30％的二氯甲烷-甲醇(V:V)洗脱液中，缩水甘油酯和氯丙醇单酯逐渐完成洗脱，强疏水性的氯丙醇双酯未能洗脱；80％和100％的二氯甲烷-甲醇(V:V)洗脱液可实现全部目标化合物的完全洗脱，如表3所示，从尽可能降低油脂类化合物干扰的角度出发，确定80％的二氯甲烷-甲醇(V:V)作为洗脱液。因此，根据上述实验结果，最终将C18净化条件确定为：甲醇提取液上样后平衡5min，采用纯甲醇进行淋洗，可有效去除奶粉中小分子杂质干扰，最后经80％的二氯甲烷-甲醇(V:V)作为洗脱剂进行洗脱。

表3 C18净化柱在不同洗脱条件下，7种代表性氯丙醇酯类化合物的回收率(n＝6,％)

“-”代表未检出

足够体积的洗脱剂可以很好地保证氯丙醇酯类化合物的回收率，以80％的二氯甲烷-甲醇(V:V)作为洗脱剂，通过二氯甲烷的加入，首先使一些中等极性的缩水甘油酯(缩水甘油-棕榈酸酯，缩水甘油-硬脂酸酯)和氯丙醇单酯(3-氯丙醇-2-硬脂酸单酯和3-氯丙醇-1-棕榈酸单酯)从净化柱上洗脱下来，然后随着二氯甲烷的逐级渗入，使得部分低极性的氯丙醇双酯(3-氯丙醇-1,2-棕榈酸二酯，2-氯丙醇-1,3-硬脂酸二酯和3-氯丙醇-1-棕榈酸-2-硬脂酸二酯)最终完成洗脱。与此同时，奶粉中包含的主要油脂类化合物-棕榈酸甘油三酯(简称TAG)([M+Na]

第二级提取采用80％二氯甲烷-甲醇(V:V)作为提取液，在保证低极性氯丙醇双酯提取率的同时，不可避免的会导致油脂成分被提取，该类杂质的存在会在后续质谱分析中产生强烈的离子化抑制效应并抬高基线水平，进而导致本就低含量的氯丙醇类化合物含量值大大降低甚至不被检出。有研究表明，中性氧化铝粉通过氢键作用力可以很好地吸附油脂，但是过量使用则会对目标化合物造成损失。基于此，实验中针对中性氧化铝粉的添加量进行了详细优化，实验过程如下：取上述7种代表性氯丙醇酯类化合物的混合标准溶液10μL(C＝1.0mg/mL)，氮吹近干后，采用婴幼儿配方奶粉和特殊医学用途配方奶粉的脂肪样品在步骤(3)得到的二级提取液(80％二氯甲烷-甲醇)有机相B进行复溶，所得混合液按照步骤(4)用中性氧化铝粉末进行净化，具体步骤为：混合液氮吹浓缩近干，加入2.0mL甲醇溶液，分别加入0.1g，0.2g，0.5g，1.0g，2.0g和5.0g中性氧化铝粉充分震荡，以12000r/min高速离心，得到上清液C及沉淀C；测量混合液和上清液C氮吹充分后的残余油脂的精确质量值计算除油率，除油率(％)＝(M

本文通过向提取出的脂肪样品中添加上述7种代表性氯丙醇酯(0.05mg/kg)，分别考察上述两级提取、净化方法对应各自加标回收率的影响。两种奶粉的脂肪样品中7种代表性氯丙醇酯(0.05mg/kg)在两级提取、净化方法后的回收率(n＝6，％)如表4所示，结果表明：7种代表性氯丙醇酯回收率均平稳地保持在80％以上(82.9％～92.6％之间)，其中偏极性的缩水甘油酯(缩水甘油-棕榈酸酯，缩水甘油-硬脂酸酯)和中等极性的氯丙醇单酯(3-氯丙醇-2-硬脂酸单酯和3-氯丙醇-1-棕榈酸单酯)主要存在一级提取液中，经C18小柱净化后，回收率稳定维持在70.6％～77.7％之间；氯丙醇双酯(3-氯丙醇-1,2-棕榈酸二酯，2-氯丙醇-1,3-硬脂酸二酯和3-氯丙醇-1-棕榈酸-2-硬脂酸二酯)主要存在二级提取液中，经中性氧化铝粉吸附除油后，回收率稳定维持在71.9％～73.3％之间，充分验证了该净化方法的可行性。

表4 7种代表性氯丙醇酯(0.05mg/kg)在两级提取、净化方法后的回收率(n＝6，％)

P:棕榈酸,S:硬脂酸,MCPD:氯丙醇；

加标回收结果分析

根据上述优化得到的最佳分级提取体系，对两种奶粉中氯丙醇酯进行多级净化提取和液相色谱-质谱联用技术分析，所得结果如表5所示。结果显示，氯丙醇酯在0.01～0.2μg/mL线性范围内，其线性关系良好(r

表5 7种代表性氯丙醇酯在婴幼儿配方奶粉和特殊医学用途配方奶粉中的添加水平、线性范围及其回收率的实验数据

P:棕榈酸,S:硬脂酸,MCPD:氯丙醇；

A:婴幼儿配方奶粉,B:特殊医学用途配方奶粉.

本申请根据3大类氯丙醇酯类化合物的极性范围，包括：缩水甘油酯，氯丙醇单酯和氯丙醇双酯，以及奶粉基质样品中高蛋白质、高脂肪的属性特征，建立了奶粉中氯丙醇酯类化合物分级提取、净化方法。首先，甲醇和二氯甲烷/甲醇(8:2，V:V)作为提取溶剂，两种溶剂的极性覆盖范围广，完全满足3大类氯丙醇酯化合物的提取需求。第一级采用甲醇振荡提取、C18小柱净化，可实现对缩水甘油酯和氯丙醇单酯的有效提取分离；第二级采用甲醇提取，二氯甲烷辅助提取、中性氧化铝粉净化，去除油脂的同时，可实现对氯丙醇双酯的提取分离。其次，通过合并第一、二级提取液，即可实现奶粉中氯丙醇酯类化合物的高通量检测。本方法对不同奶粉基质及不同理化性质的化合物兼容性强，为丰富奶粉中氯丙醇酯种类及后期探究婴幼儿奶粉中氯丙醇酯的毒理学奠定了实验基础。