雷金斯堡约克氏菌菌株GXAS49-I及其应用

摘要

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株雷金斯堡约克氏菌GXAS49‑I及其应用。具有重金属吸附作用的雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)GXAS49‑I，保藏编号为GDMCC No.62497。菌株GXAS49‑I可高效吸附土壤或水体中重金属铅、铜、镉，因此可用于制备土壤修复剂。同时菌株GXAS49‑I还具备较好的产氨能力，也可以产生吲哚乙酸，对植物生长能具有促生作用，因此，本发明还提供了菌株GXAS49‑I在微生物菌肥中的应用。

说明书

【技术领域】

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及雷金斯堡约克氏菌菌株GXAS49-I及其应用。

【背景技术】

随着我国工业化的快速发展和对自然资源的进一步开放，生态环境中的重金属污染日趋严重。重金属污染主要有铜、镉、铅、汞、六价铬等代表性重金属离子，具有持续的毒性和生物难降解性，并且可随食物链不断累积，进入人体内导致多种疾病的发生。其中铜的污染主要来自采矿业和农田施加的有机肥，土壤和矿石中含有的大量铜元素受雨水冲刷或地表径流影响，会进一步对地下水造成严重的污染。铅的污染主要来自采矿业和金属加工业，在工业生产中产生的废渣、废水的排放过程会对土壤以及地下水造成污染。镉元素作为重金属中毒性较为突出的一种元素，在灌溉水质标准中对其的规定也较为严格。但从上世纪80年代以来，逐渐成为农业灌溉用水重要组成的污灌污水镉含量超标的问题却一直没有得到有效解决，而随着我国经济的进一步发展和水资源供给的日趋紧张，污水作为一种宝贵的水资源也会越来越广泛地应用到农业灌溉中。实际情况下的污水处理中，常常由于进水污水中金属浓度较低，导致污水厂对金属的平均去除率普遍低于60％。因此，进一步优化重金属污水与土壤的治理与修复方法迫在眉睫。

从污染水源中去除或降低重金属污染的方式可以分为物理法、化学法和生物法。物理法和化学法包括膜技术、过滤、离子交换、活性炭吸附、电化学处理、化学沉淀、蒸发等。然而，当水溶液中金属离子处于较低浓度时，化学沉淀和电化学处理几乎没有效果，而且也会产生大量难以处理的污泥，离子交换、膜技术和活性炭吸附工艺在处理低浓度重金属废水时则成本高昂，难以大规模使用。

由于物理法和化学法在低浓度重金属废水的处理上效果不佳，近年来，生物法逐渐成为处理高体积、低浓度重金属复合废水的理想选择。去除重金属的生物法包括生物吸附和生物矿化，生物吸附可以利用各种生物来源的自然材料将溶解的金属离子自然吸附，达到生物富集金属离子的效果；生物矿化可由细胞的特异性代谢途径产生重金属沉淀，从而使得环境中重金属的毒性降低或易于恢复为无毒状态。生物法的能耗小、无二次污染的特点使其成为重金属污染领域的研究热点。

目前对生物矿化的污染去除应用研究主要集中于镉和铅，使用生物矿化的方法去除铜污染的技术还存在很多不足。由于环境中铜污染的来源有别于铅等重金属元素，铜元素随着有机肥料的施用以及地表径流的冲刷分布于农田、冲积平原等区域，所以铜污染对于作物生长的影响广泛高于铅等元素的污染。另一方面，虽然镉和铅在环境中的含量相对铜更低，但毒性更大，其中镉在灌溉条件下更存在明显的向下迁移趋势，这将使得土壤和地下水受到威胁。因此，对环境的重金属污染处理中，需要结合污染程度和毒性等不同重金属元素积累的特点，建立对多种重金属具有去除功能的污染处理方法。

综上，基于对多种重金属污染治理与土壤修复的迫切需求，筛选得到一株对铜离子以及其他重金属具有矿化和去除能力的菌株，是解决当前重金属污染问题的重要方式。

【发明内容】

有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种具有吸附或除去重金属和促生作用的雷金斯堡约克氏菌菌株GXAS49-I及其应用。

为达到上述目的，本发明筛选得到一株雷金斯堡约克氏菌(Yokenellaregensburgei)菌株GXAS49-I，其保藏编号为GDMCC No.62497，保藏日期：2022年5月30日，保藏地址为：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)。

本发明的雷金斯堡约克氏菌菌株GXAS49-I(Yokenella regensburgei)来源于芭蕉树根部附近获取的土壤样品，将筛选得到的菌株经基因组提取、PCR扩增、测序进行细菌菌种鉴定，得到了长度为1354bp的序列。同源序列对比分析表明，菌株的16S rDNA序列与雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)的同源性达100％，将该菌种归于约克氏菌属。雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)菌株GXAS49-I的16S rDNA的核苷酸序列如序列表所示。

本发明还提供一种土壤修复剂，活性成分包括权利要求1所述的雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)菌株GXAS49-I。

本发明还包括包含所述的雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)菌株GXAS49-I的菌剂。

本发明还包括所述雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)菌株GXAS49-I或所述重金属污染修复剂或所述的菌剂在吸附和/或除去矿化重金属中的应用。

进一步说明，所述的重金属为铜和/或铅和/或镉。

本发明还包括所述雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)菌株GXAS49-I在植物促生上的应用，其特征在于，所述雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)菌株GXAS49-I菌株可以产生生长激素吲哚乙酸IAA和促进合成氨。

本发明还包括包含所述的雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)菌株GXAS49-I的微生物菌肥。

本发明还提供一种应用所述雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)菌株GXAS49-I吸附和/或除去矿化重金属的方法，所述方法为：将菌种接种于LB液体培养基中，培养至OD600值在0.5-0.6之间，得到含有菌体的培养液，然后离心、去上清、离心、水重悬后再离心、去上清，调整OD

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

利用本发明雷金斯堡约克氏菌Yokenella regensburgei菌株GXAS49-I制备的吸附剂，在含有铜/镉/铅的水溶液中吸附金属离子，吸附48h时，其铅去除率可高达90.4％，其对铜、镉的去除率也分别达到了48.7％、32.0％。利用本发明雷金斯堡约克氏菌Yokenellaregensburgei菌株GXAS49-I制备的菌剂，在加入营养物质的培养条件下进行吸附和矿化，培养120h内，菌株对初始浓度为40mg/L的铜去除率可达85％以上；对初始浓度为130mg/L的铅去除率可达58.2％；对初始浓度为84mg/L的镉去除率可达36.72％。同时，菌株GXAS49-I还具备较好的产氨能力，也可以产生吲哚乙酸，对植物生长可能具有促生作用。利用本发明提供的雷金斯堡约克氏菌可处理重金属污染，其中对铜的矿化去除和对铅的吸附去除效果较为优秀，同时也对镉具有一定的矿化和吸附去除效果。本方法与物理、化学的方法相比，具有处理效果好、不会造成二次污染等优点。同时，本发明所述菌株还具有促进植物生长的潜力。综上所述，本发明菌株GXAS49-I在重金属污染的废水处理以及污染土壤修复领域都有着广阔的应用前景。

【附图说明】

图1：菌株GXAS49-I的系统发育树(A)和在含有100mg/L的硫酸铜的LB培养基中培养的菌液照片(B)。

图2：GXAS49-I菌株对重金属离子的吸附去除曲线。

图3：培养条件下GXAS49-I菌株对铜离子的去除曲线。

图4：培养条件下GXAS49-I菌株对铅离子的去除曲线。

图5：培养条件下GXAS49-I菌株对镉离子的去除曲线。

图6：菌株GXAS49-I在0.63mM铜离子的培养液体系中菌体的扫描电镜(SEM)。图(A)，菌株GXAS49-I在0.63mM铅离子的培养液体系中菌体的扫描电镜(SEM)；图(B)，菌株GXAS49-I在0.63mM镉离子的培养液体系中菌体的扫描电镜(SEM)图(C)。

图7：氯化铵标准曲线。

图8：IAA标准曲线。

图9：菌株在0-960mg/L铜浓度的LB平板上的生长照片。(A)菌株在0-2340mg/L铅浓度的LB平板上的生长照片；(B)菌株在0-426mg/L镉浓度的LB平板上的生长照片(C)。

【具体实施方式】

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

重金属母液：

铜母液：称取12.48g的五水硫酸铜溶解于50mL去离子水中，配制成浓度为159.61g/L(1M)的硫酸铜母液。

铅母液：称取18.97g的三水乙酸铅溶解于50mL去离子水中，配制成浓度为325.29g/L(1M)的醋酸铅母液。

镉母液：称取219.32g的二水氯化镉溶解于50mL去离子水中，配制成浓度为183.32g/L(1M)的氯化镉母液。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。

LB平板：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L。

实施例1：雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)GXAS49-I菌株的筛选、鉴定1、菌株的筛选

具体步骤如下：

(1)土壤样品采自广西南宁市坛洛镇芭蕉树的根部，将分离得到的不同菌株在25℃，220r/min条件下摇床过夜培养得到活化菌株；

(2)向每管20mL LB液体培养基中分别接种0.1mL步骤(1)得到的活化菌液，空白对照仅加入20mL LB液体培养基，在每管培养基分别加入终浓度为100mg/L的硫酸铜溶液，在25℃，180r/min条件下于摇床中震荡培养24h和48h后，采用Gracioso LH等人的观察方法(Copper mining bacteria:Converting toxic copper ions into a stable single-atom copper.Sci Adv.2021Apr 23；7(17):eabd9210.)对培养液进行颜色对照观察，筛选出可能具有铜矿化功能的菌株。

(3)结果如图1B所示，筛选得到的菌株被标记为GXAS49-I，菌株在100mg/L的硫酸铜浓度下生长可导致含有铜离子的LB液体培养基颜色由绿变为橙，并产生少量的黄褐色矿化沉淀，这种现象在菌株未加入铜离子进行培养时并不发生，这说明菌株GXAS49-I具有转化铜离子的潜力，因此做菌株GXAS49-I的下一步鉴定。

2、菌株的鉴定

具体步骤如下：

(1)菌株的DNA提取：将菌株GXAS49-I的单菌落接种于5ml的LB培养基中培养16小时，3000g离心10分钟，上清液弃去，沉淀用无菌水重新悬浮洗涤，3000g离心10分钟，上清液弃去。沉淀在1ml缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5,1.2M山梨糖醇，10mM的EDTA)中重新悬浮并加入50μg zymolyase，30℃温浴30分钟。随后依次加入100μL 10％SDS，1ml苯酚-氯仿异戊醇混合液，充分混匀后6000g离心15分钟分层。将上清液中的透明水相转移到新试管中，加入5μL核糖核酸酶，37度恒温2小时。加入0.5mL苯酚-氯仿，充分混匀后以6000g离心15分钟。上清液中透明的水相被转移到一个干净的管，加入十分之一体积的3M醋酸钠和2倍体积的无水乙醇。置于-20℃沉淀2小时后以6000g离心15分钟，弃去上清液。沉淀用70％乙醇洗涤2次后，DNA在室温下风干。

(2)菌株的分子鉴定：提取的DNA用nanodrop测定浓度并稀释到合适浓度做聚合酶链反应(PCR)。引物为16s rRNA区通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT),由金唯智公司合成。PCR反应体系参照Takara公司PrimeSTAR HS(Premix)聚合酶说明书，反应程序为：98℃预变性3min，然后进入循环，98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段经DNA胶回收试剂盒回收纯化后送由金唯智公司测序，测序引物为27F/1492R。测序结果利用BLAST分析程序在NCBI核酸数据库在线比对，结果显示该菌株与细菌Yokenella regensburgei 16S rRNA序列比对同源度为100％，比对使用BLAST在NCBI数据库中进行，菌株GXAS49-I的核苷酸序列如序列表所示，菌株在系统发育树上的位置如图1A所示。

(3)经鉴定，菌株GXAS49-I为Yokenella regensburgei，属于约克氏菌属，所述菌株GXAS49-I在LB固体培养基中，其菌落特征为：菌光滑，圆形，黄白(图9A)。

鉴定得到的雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)菌株GXAS49-I，已经在2022年5月30日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No.62497，保藏地址为：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2：雷金斯堡约克氏菌Yokenella regensburgei GXAS49-I菌株的吸附性能

具体步骤如下：

1、雷金斯堡约克氏菌Yokenella regensburgei GXAS49-I菌悬液的制备

(1)挑取雷金斯堡约克氏菌Yokenella regensburgei GXAS49-I单菌落接种至添加有35mL LB液体培养基的50mL离心管中，培养至OD

(2)将步骤(1)得到的培养液5000r/min离心10min后去掉上清，用纯水冲洗沉淀的菌体后再次5000r/min离心10min，去掉上清后通过纯水分别将菌悬液的浓度调整为OD

2、将铜、铅、镉的母液按照终浓度0.63mM(铜浓度约40mg/L、铅浓度约130mg/L、镉浓度约80mg/L)的添加量，分别添加至步骤1得到的雷金斯堡约克氏菌Yokenellaregensburgei GXAS49-I浓度OD

分别将上述含有菌悬液OD

吸附去除率测定的结果如图2所示，经检测，采用本发明提供的菌株作为吸附剂在吸附反应48h时，雷金斯堡约克氏菌Yokenella regensburgei GXAS49-I在OD

本发明要求保护的一株约克氏菌，能够吸附不同种类的重金属，可以作为重金属吸附剂应用于重金属污染水土环境的治理与修复。

实施例3：雷金斯堡约克氏菌Yokenella regensburgei GXAS49-I菌株的矿化吸附性能

用LB液体培养基将菌株制成菌悬液，调节OD

铜/铅/镉的浓度通过原子吸收光谱仪测定，各培养液体系溶液取样进行离心，取定量上清液用纯水稀释一定倍数，利用原子吸收光谱仪测定铅/铜/镉的浓度，并根据测定的结果计算GXAS49-I菌株在利用外源营养物质进行繁殖、矿化和吸附时对相应金属离子的去除率。

培养液体系的金属离子浓度变化和去除率的测定结果如图3、图4和图5所示，在培养液体系中，一开始随着时间的延长，培养液中相应的金属离子浓度不断降低，菌株GXAS49-I对所加入重金属的去除率逐渐增加。在48h时，铜和铅的去除率分别达到了85％和38％。在含有铜的培养液体系中，48h时对铜的去除率达到一个峰值，随后菌株GXAS49-I对铜表现出轻微的解吸作用，但铜去除率基本上维持在75％以上。在含有铅的培养液体系中，48h时对铅的去除率达到40％左右，随后的24h内菌株GXAS49-I对铅的去除率有接近20％的上升，在培养120h时菌株GXAS49-I对铅的去除率基本维持在55％以上。在含有镉的培养液体系中，随着培养时间的增加，GXAS49-I菌株对镉的去除率也逐渐增加，但增加的幅度较铜/铅的去除率更小，最终经过120h的培养，菌株对镉的去除率也达到了36％左右。

以上测定金属离子去除率的实验在含有外源营养成分的培养液体系中进行，与例2不同的是，菌剂加入后菌株可利用体系中的营养物质进行生长繁殖，从而积累了进行吸附反应的菌体量。同时菌株GXAS49-I还可以利用体系中的营养物质进行生物矿化反应，将可溶重金属离子转化为金属盐沉淀，如图6(A-C)为含有相应金属离子培养液体系中的的菌体SEM观察结果，图6A、B、C所拍摄的经过去离子水清洗的菌体样品中仍存在集中的盐沉淀区(亮斑块状处)，这说明GXAS49-I菌株经过生物矿化的过程使金属离子产生了难溶的沉淀。对比例2的吸附实验，生物矿化效应使得菌株GXAS49-I对于铜离子的去除率大大提升，但对于镉离子去除效应的提升并不明显，对于铅离子的去除率低于例2中的90％，这说明GXAS49-I菌株对于铅/镉离子的去除过程中，矿化的效率低于吸附的效率。以上结果说明雷金斯堡约克氏菌Yokenella regensburgei GXAS49-I菌株对铜/铅/镉离子都具有生物矿化的效应，可以通过将金属由离子态转变为不溶金属盐从而去除溶液中的重金属，并且能够将GXAS49-I菌株对于铜的去除率提升到85％左右。

本发明要求保护的一株约克氏菌，能够高效吸附和矿化不同种类的重金属，可以用于重金属污染水土环境的治理与修复。

实施例4

雷金斯堡约克氏菌Yokenella regensburgei GXAS49-I菌株的促生特性

菌株产氨定量检测方法如下：

将菌株接种含有1％蛋白胨水溶液中培养中培养72h，取1mL上清加入1mL纳氏试剂(7.5g KOH溶于25mL超纯水，2.5g KI溶于水后加入HgCl

菌株产IAA定量测试方法如下：

将菌株接种在添加0.5％的色氨酸与不添加色氨酸的PDB培养基中，在最适温度下培养72小时后，离心，取上清液与Salkowski试剂(加入51mL 0.5M FeCl

表1菌株在不同条件下的IAA产量

表2菌株的氨产量

植物促生长试验结果表明，菌株Yokenella regensburgei GXAS49-I在加入色氨酸的PDB培养基中能够产生5.89μg/mL的IAA(表1)，且菌株的氨产量高达3.80mM/mL(表2)，这说明菌株产IAA的能力较弱，但产氨的能力较强。

实施例5

雷金斯堡约克氏菌Yokenella regensburgei GXAS49-I菌株的抗重金属特性

具体步骤如下：

(1)在实施例2的步骤1得到的雷金斯堡约克氏菌Yokenella regensburgei菌株GXAS49-I悬液的基础上，将菌悬液调整为OD

(2)吸取步骤(1)得到的菌悬液2μL在设置的重金属(铜/镉/铅)浓度梯度的LB平板上点板，每个浓度梯度重复点样6次，28℃培养48h后观察生长情况。

菌株Yokenella regensburgei GXAS49-I在重金属(铜/镉/铅)的LB平板上培养48h生长情况如图9，菌株GXAS49-I保持正常生长的最大铜浓度在480mg/L左右(图9A)；最大铅浓度则是1560mg/L(图9B)；最大镉浓度则是142mg/L(图9C)。因此，GXAS49-I菌株对于铜、铅的抗性显著优于菌株对镉的抗性，同时GXAS49-I菌株在重金属(铜/铅/镉)离子浓度100mg/L时都能保持稳定正常生长，这证明其可以广泛的应用于在废水环境中吸附去除重金属(铜/铅/镉)离子。

上述结果表明，在铜/镉/铅溶液中采用雷金斯堡约克氏菌Yokenellaregensburgei GXAS49-I菌株作为吸附剂和菌剂使用，分别经过48h、120h的吸附和矿化试验，最终证明菌株能够大大降低溶液中的中可溶重金属的含量，也避免了重金属污染废水处理过程中出现二次污染的情况。同时发现此菌株也具有一定的植物促生作用，这对于土壤的重金属污染处理和环境修复都具有积极意义。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。