GLP-1R小分子激动剂在糖尿病及其相关并发症中的应用及药物

摘要

本发明公开了GLP‑1R小分子激动剂在糖尿病及其相关并发症中的应用及药物，属于糖尿病相关并发症药物制备技术领域，本发明通过研究确定了以大叶茜草素、五味子乙素为代表的GLP‑1R小分子激动剂，能够通过与GLP‑1R蛋白特异性结合，发挥广泛而全面的作用，可用于治疗糖尿病及其相关并发症。

说明书

技术领域

本发明属于糖尿病相关并发症药物制备技术领域，涉及GLP-1R小分子激动剂在制备以GLP-1R蛋白为靶点的糖尿病相关并发症中的应用及药物。

背景技术

糖尿病是一种由遗传和环境因素共同作用所致的一种代谢性综合征，以慢性高血糖为其主要特征，常伴有多脏器、多系统的广泛损害。糖尿病已成为21世纪全球范围内面临的最为严峻的社会健康问题之一。其中，2型糖尿病(type2diabetes mellitus，T2DM)是最常见的糖尿病类型，约占全球糖尿病患者总数的90％。T2DM是以胰岛素抵抗和慢性低水平炎症为特征的代谢性疾病，随着疾病的进展会引发多种并发症，包括视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病足、非酒性性脂肪肝、糖尿病性心肌病、糖尿病脑病等。另有研究表明糖尿病已经成为心脑血管疾病、阿尔兹海默症等疾病的独立危险因素。而T2DM患者“多饮、多食、多尿、体重减轻”的症状并不明显，患者疾病进程往往先经历糖尿病前期，其中包括空腹血糖受损、糖耐量异常而后进展为糖尿病，同时可能伴发多种并发症。

目前T2DM的治疗药物根据作用机制主要分为糖调节剂(如α糖苷酶抑制剂)、促进胰岛素分泌型药物(如磺酰脲类和格列奈类)、胰岛素增敏剂(如双胍类、PPARγ激动剂)、肠促胰岛素增强剂(如GLP-1类似物和DPP-IV抑制剂)和胰岛素类似物(如普兰林肽)等。从糖尿病治疗药物的全球市场看，近十年来以GLP-1类似物、DPP-IV抑制剂和SGLT-2抑制剂为代表的新机制药物，以其低血糖风险小、肝肾功能损害小、耐药性风险小等优势在非胰岛素的药物市场份额显著增加。其中以利拉鲁肽为代表的GLP-1类似物以其广泛而全面的治疗作用，不仅在糖尿病的治疗中占据重要的市场份额，而且在减肥、非酒精性脂肪肝病的治疗中具备重要的价值。

肠促胰高血糖素肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)是由肠道L细胞分泌的一种肽类激素，其通过与胰腺β细胞表面的GLP-1受体结合，发挥促进胰岛素分泌，降低胰高血糖素分泌的生理作用。然而，内源性GLP-1由于被二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4，DPP-IV)降解，在体内的半衰期仅有2～3分钟。通过对内源性GLP-1的结构修饰，在保存其内在活性的同时，降低水解，延长半衰期。基于此开发出的以艾塞那肽、利拉鲁肽、索马鲁肽为代表的GLP-1类似物已投入临床。然而GLP-1类似物存在着胃肠道不良反应重，价格昂贵，使用局限等问题，限制了其临床应用。对GLP-1R的小分子激动剂及正向变构调节剂是一种新的研究方向，多家公司的研究已经初现成效，小分子激动剂通过直接或间接激活GLP-1R，促进内源性GLP-1释放，引发下游信号通路，促进胰岛素分泌，从而起到降低血糖的作用。GLP-1受体是一种在肠道、胰腺、中枢神经系统、心脏、肾脏、脉管系统广泛表达的B族G蛋白偶联受体(GPCR)。基于GLP-1R在机体多种组织、细胞中广泛分布的特点，开发GLP-1R特异性激动剂能通过激活受体，产生包括改善胰岛素抵抗、缓解非酒精性脂肪肝、治疗糖尿病肾病、改善认知功能等多种生物学效应。

模拟内源性肽与GLP-1R结合时较大的表面接触是巨大的挑战，因而对于能直接激活GLP-1R的小分子物质的研究已有数年之久。目前小分子药物的研究主要包括两种途径：一为直接能直接激活GLP-1R的全激动剂，可使内源性GLP-1(7-36)NH

细胞膜色谱法(Cell membrane chromatography，CMC)是一种基于在体内模拟膜受体与配体特异性识别、结合特性的仿生色谱法。其通过将活体细胞的细胞膜固定在特定载体表面构成细胞膜固定相，在体外模拟药物分子与细胞膜受体的相互作用过程，选择性地识别并结合化学成分，从而从分子水平上探讨中药的作用机制。利用配体和膜受体的结合特性，有效地识别复杂样品中产生生物学效应(药物、抗体、酶、细胞因子等)的特定目标成分，同时具备生物学活性和色谱分离的功能。CMC是揭示配体受体作用特征、筛选和发现靶物质、实现药物质量精准控制的分析工具，能够实现便捷地动态性的模拟药物与受体相互作用的过程，对药物与受体亲和力进行定性和定量分析，同时对结合状态的药物进行色谱分离、活性筛选与药物鉴定，能实现高通量筛选与鉴定。

中药是中华民族的瑰宝，古往今来降糖的中药处方不胜枚举。然而，中药作为一种复杂成本，其发挥降糖作用的成分及其降糖机制的研究仍不清楚。此外，GLP-1R小分子激动剂在糖尿病及其并发症的治疗中的作用仍为空白。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供GLP-1R小分子激动剂在糖尿病及其相关并发症中的应用及药物。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了GLP-1R小分子激动剂在制备治疗糖尿病及其相关并发症的药物中的应用。

优选地，所述的药物是以GLP-1R蛋白为靶标的抗糖尿病及其相关并发症的药物。

优选地，所述的药物为激动GLP-1R引发下游生物学效应的药物。

优选地，所述药物是能够与GLP-1R结合发挥受体激动作用的药物。

进一步优选地，所述药物为能够在SiO

优选地，所述的GLP-1R小分子激动剂为大叶茜草素或五味子乙素。

优选地，所述并发症包括糖尿病相关神经系统损伤、糖尿病肝损伤、糖尿病胰腺损伤和糖尿病肾脏功能损伤。

本发明还公开了一种治疗糖尿病及其相关并发症的药物，所述的药物是由GLP-1R小分子激动剂和药学上可接受的辅料制成的制剂。

优选地，所述的GLP-1R小分子激动剂为大叶茜草素或五味子乙素。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了GLP-1R小分子激动剂在制备糖尿病及其相关并发症的药物的用途，通过SiO

进一步地，本发明测定大叶茜草素、五味子乙素对高糖损伤的大鼠嗜铬细胞瘤细胞的保护作用，证实大叶茜草素、五味子乙素对糖尿病神经损伤的保护作用；测定大叶茜草素、五味子乙素灌胃处理的雄性C57小鼠的血清尿素氮水平，证实了大叶茜草素、五味子乙素对T2DM小鼠肾脏功能的保护作用；此外对大叶茜草素和五味子乙素灌胃处理的小鼠胰腺、肝脏、肾脏及海马的显微结构的观察，证实了以大叶茜草素和五味子乙素为代表的GLP-1R小分子对糖尿病相关并发症的治疗作用。以上研究明确了GLP-1R小分子具备改善糖尿病相关并发症，能够用于糖尿病相关并发症药物的制备。

附图说明

图1为GLP-1R小分子激动剂对对高糖损伤PC12细胞存活率的影响及对高糖损伤PC12细胞的保护作用；其中，(a)为五味子乙素；(b)为大叶茜草素；

图2为中药小分子对T2DM小鼠海马病理学改变的影响；

图3为中药小分子对T2DM小鼠胰腺病理学改变的影响；

图4为中药小分子对T2DM小鼠肝脏病理学改变的影响；

图5为GLP-1R小分子激动剂对T2DM小鼠肾脏功能的影响；其中，(a)为大叶茜草素和五味子乙素对T2DM小鼠血清尿素氮水平的影响；(b)为大叶茜草素和五味子乙素对T2DM小鼠肾脏病理学改变的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明涉及的实验材料如下：

大叶茜草素分子为C

五味子乙素分子式为C

GLP-1R高表达细胞是将含人全长基因序列的慢病毒质粒载体转染HEK293细胞，并通过嘌呤霉素进行为期14天的抗性筛选，最终获得；

PC12细胞购买自ATCC上海细胞库；

雄性C57小鼠购于西安交通大学实验动物中心。

实施例1、大叶茜草素、五味子乙素与GLP-1R蛋白有特异性结合

CMC是一种亲和色谱，通过将特定受体过表达细胞膜制备成固定相，在仿生条件下实现高通量筛选与膜受体特异性结合的组分，是筛选复杂成分中的有效成分的可靠手段。构建GLP-1R高表达细胞，制备细胞膜，与活化的硅胶吸附制备细胞膜色谱固定相，采用湿法装柱后得到SiO

表1中药小分子在GLP-1R蛋白高表达细胞膜色谱上的保留时间

可以看出，大叶茜草素、五味子乙素在GLP-1R高表达细胞膜色谱柱上有保留，在空白对照的色谱柱上无保留。上述结果表明，大叶茜草素、五味子乙素与GLP-1R蛋白有良好的特异性结合作用。

实施例2、大叶茜草素、五味子乙素与GLP-1R的蛋白结合位点考察

分子对接研究使用AutoDock Vina软件进行。输入蛋白质X射线晶体结构(PDB代码：5VAi)。蛋白结构去除水分子并添加氢原子，并利用Tripos力场和Pullman电荷进行能量最低处理。采用ChemDraw 19.0版本绘制大叶茜草素结构，并用ChemDraw 3D软件对结构进行优化。用AutoDock软件对配体结构进行优化，将配体残基中的电荷进行分散，判定配体的root并对其中可扭转的键进行选择。在Linux终端下运行AutoDock软件，依次加载优化后的蛋白和能量优化后的大叶茜草素，通过Autogrid计算格点能量，采用拉马克遗传算法，通过自由能方法评价配体与受体的接合情况。

结果如下表2所示：

表2大叶茜草素与GLP-1R蛋白分子对接结果

可以看出，大叶茜草素与GLP-1R蛋白有1个结合位点，为GLY216。五味子乙素与GLP-1R蛋白有2个结合位点，分别为SER72和LEU256。

实施例3、大叶茜草素、五味子乙素对高糖损伤大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞细胞的保护作用

PC12细胞以3×10

结果如图1所示，可以看出，大叶茜草素、五味子乙素对高糖损伤PC12细胞具有保护作用且具有剂量依赖性。

实施例4、大叶茜草素、五味子乙素对T2DM小鼠胰腺、海马、肝脏组织形态学的影响

雄性C57小鼠购于西安交通大学动物实验中心，适应性喂养一周，待体重达到20±2g，对照组小鼠给予普通饲料喂养，实验组给予高脂饲料(60％脂肪、20％蛋白质、20％碳水化合物)喂养，喂养8周后，开始造模。对所有组小鼠禁食不禁水12h后，对照组采用腹腔注射柠檬酸钠缓冲液，实验组小鼠腹腔注射小剂量STZ(60mg/kg/day)，连续注射3天。注射完3天后，对所有组小鼠禁食不禁水6h，尾静脉采血测定各组小鼠的空腹血糖(FBG),血糖值大于16.7mmol/L视为T2DM造模成功。将造模成功的小鼠随机分为9组，模型组、利拉鲁肽组(GLP-1R阳性药组)大叶茜草素低、中、高剂量组及五味子乙素低、中、高剂量组，各组小鼠数量均为8只，对照组小鼠为20只。给处理组小鼠每天同一时间灌胃不同剂量的大叶茜草素(剂量分别为25、50、100mg/kg/day)或五味子乙素(剂量分别为50、100、200mg/kg/day)，对照组和模型组小鼠灌胃等剂量的0.5％CMC-Na，利拉鲁肽组给于皮下注射300μg/kg/day利拉鲁肽，连续给药6周，第6周末，将小鼠眼眶取血后处死，收集小鼠肝脏、海马、胰腺、肾脏组织制成切片开展HE染色，判定药物处理对于组织显微形态学的影响。结果如下所示：

1、GLP-1R小分子激动剂对T2DM小鼠的海马显微形态学的影响

HE染色观察各组小鼠海马的病理改变。实验结果如图2所示，各组之间的海马CA3和DG区无显著差异。而在CA1区，模型组的神经元数量明显低于对照组，而Lira和小分子(大叶茜草素和五味子乙素)治疗能显著增加T2DM小鼠海马CA1区神经元数量。

2、GLP-1R小分子激动剂对T2DM小鼠的胰腺显微形态学的影响

HE染色观察胰腺组织的病理学改变。如图3所示，图3中，a为Control(对照组)，b为Model，c为Lira，d为大叶茜草素低剂量组(Mollugin-L)，e为大叶茜草素中剂量组(Mollugin-M)；f为大叶茜草素高剂量组(Mollugin-H)；g为五味子乙素低剂量组(Schisandrin B-L)；h为五味子乙素中剂量组(Schisandrin B-M)；i为五味子乙素高剂量组(Schisandrin B-H)。可以看出，对照组胰岛体积较大，内含丰富的细胞；与对照组相比，模型组胰岛面积明显减小；与模型组相比，Lira组和各剂量小分子(大叶茜草素和五味子乙素)可增加T2DM小鼠的胰岛体积。

3、GLP-1R小分子激动剂对T2DM小鼠的肝脏显微形态学的影响

中药小分子对T2DM小鼠肝脏病理学改变的影响。对肝脏进行HE染色，观察其病理学改变。结果如图4所示，图4中a为Control；b为Model；c为Lira；d为大叶茜草素中剂量组(Mollugin-M)；e为大叶茜草素高剂量组(Mollugin-H)；f为五味子乙素高剂量组(Schisandrin B-H)。从图中可以看出，与对照组相比，模型组肝细胞浆内出现大量大小不一的圆形空泡(脂滴)，提示模型组小鼠中脂肪肝的存在。与模型组相比，Lira和中药小分子治疗可显著降低脂滴密度。提示中药小分子可降低T2DM小鼠的脂肪肝。

4、GLP-1R小分子激动剂对T2DM小鼠的肾脏显微形态学的影响

为了检测肾损伤情况，检测血清中尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平。结果参见图5中(a)图，可以看出，与对照组相比，模型组BUN水平明显升高；与模型组相比，大叶茜草素和五味子乙素可显著降低BUN水平。

对肾脏进行HE染色，进一步观察其病理学改变。参见图5中(b)图，图中，a为Control；b为Model；c为Lira；d为大叶茜草素中剂量组(Mollugin-M)；e为大叶茜草素高剂量组(Mollugin-H)；f为五味子乙素高剂量组(Schisandrin B-H)。结果显示，与对照组相比，模型组肾小球增大，基底膜增厚；与模型组相比，GLP-1R小分子激动剂(大叶茜草素和五味子乙素)治疗能降低肾小球体积和基底膜厚度，提示中药小分子能够改善T2DM小鼠的肾小球肥大。

综上所述，本发明公开了以大叶茜草素和五味子乙素为代表的GLP-1R小分子激动剂治疗糖尿病相关并发症中的应用，通过细胞膜色谱法考察大叶茜草素和五味子乙素在GLP-1R蛋白高表达细胞膜色谱上的保留行为，明确了大叶茜草素、五味子乙素与GLP-1R蛋白的特异亲和作用；通过检测大叶茜草素、五味子乙素对高糖损伤PC12细胞的保护作用，评价药物对糖尿病神经系统损伤的保护作用，确定药物对糖尿病神经系统损伤有明确的保护作用；通过测定大叶茜草素、五味子乙素对T2DM小鼠海马、肝脏、胰腺和肾脏大体形态学改变的影响，明确了以大叶茜草素、五味子乙素为代表的GLP-1R小分子激动剂对海马、肝脏、胰腺和肾脏的保护作用。研究结果确定了以大叶茜草素、五味子乙素为代表的GLP-1R小分子激动剂，能够发挥广泛的药理作用，对脑、肝脏、胰腺、肾脏等组织具有广泛的保护作用，能够用于降糖药物及治疗糖尿病相关并发症药物的制备。

综上所述，以大叶茜草素和五味子乙素为代表的GLP-1R小分子激动剂能够通过与GLP-1R蛋白特异性结合，发挥广泛而全面的作用，可用于治疗糖尿病相关并发症。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。