一种鸽轮状病毒A型荧光定量PCR检测的引物和探针及其试剂盒

摘要

本发明提供一种鸽轮状病毒A型荧光定量PCR检测的引物和探针及其试剂盒，所述引物序列如下：引物PiRVA‑TF：5’‑CCGAACTGCTCCTGTATGAAT‑3’，引物PiRVA‑TR：5’‑CATTGCCCATTGCTATCCATTT‑3’；所述探针为：探针PiRVA‑probe：5’‑AGTCTGACATCCATTTCATTGCACAACC‑3’，且其5’‑端标记荧光报告基团FAM，在探针的中间和3’‑端分别标记淬灭基团DBQ1，本发明建立的方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，可用于鸽轮状病毒A型特异性检测，为后续科学研究鸽轮状病毒A型致病机理和开展分子流行病学奠定基础。

说明书

技术领域

本发明属于动物病毒学领域，具体涉及一种鸽轮状病毒A型荧光定量PCR 检测的引物和探针及其试剂盒。

背景技术

人类养鸽历史悠久，鸽经驯化成观赏鸽、赛鸽和肉鸽，拥有较强的免疫系统，加上鸽舍多采用开放式或半开放式，空气流通好，空气新鲜，相比较其他畜禽，鸽生病较少。然而，随着养鸽业规模化、集约化的迅速发展，饲养总量、饲养密度的增加，鸽的饲养方式发生了改变，由于饲养管理水平低，疫病防治意识差，加上鸽的贸易流通频繁(包括信鸽的比赛)，鸽病也越来越多，越来越严重，越来越复杂。近年来鸽病毒性传染病严重威胁着养鸽业，据国内外研究，已经报道的鸽病毒性传染病有鸽新城疫、鸽轮状病毒感染、鸽腺病毒感染、鸽圆环病毒感染、鸽疱疹病毒感染、鸽痘和H9亚型低致病性禽流感等。

轮状病毒(Rotavirus，RV)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，病毒粒子无囊膜，呈正二十面体，分3层壳体，直径约75nm，在电镜下呈车轮状，由此得名。轮状病毒基因组由11节段双链RNA构成，各段长663～3302bp。根据国际病毒分类委员会(InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses，ICTV)的最新分类，轮状病毒属包括A～J共10个病毒种。至今轮状病毒A型、D型、F型和G型均能感染禽类，截至目前轮状病毒A型、D型和G型均能感染鸽子。轮状病毒同一病毒种的不同宿主的毒株之间的基因序列往往差异明显。轮状病毒A型(Rotavirus A， RVA)一般感染特定种群的动物，此类病毒称为同源株，但偶尔也存在跨种传播现象。轮状病毒A型宿主广泛，广泛存在于哺乳动物和禽类，禽类感染后临床症状主要表现为严重腹泻、脱水、发育不良和死亡率增加。鸽感染轮状病毒A型以呕吐、腹泻、脱水和泄殖腔炎为特征。病鸽在病初精神差，食欲减退，消化功能紊乱。继而萎靡、嗜睡、不食和剧烈腹泻，粪便呈水样，严重脱水，体瘦，贫血，最后因衰竭而死亡。剖检病变主要表现为肝脏坏死和肠道黏膜充血、出血和水肿，另外机体脱水，泄殖腔发炎。轮状病毒A型感染已严重影响了养鸽业的健康发展。

实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。实时荧光定量PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时监测。由于在PCR扩增的指数期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量 PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。TaqMan探针法是指在Real-time PCR扩增反应体系中除了加入一对引物，还同时加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号。随着Real-time PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被监测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与Real-time PCR产物形成完全同步，报告信号的强度与模板DNA的拷贝数相关。由于TaqMan实时荧光定量探针在常规SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR方法的基础上，加入一条更特异性的探针，使检测目的基因只有和TaqMan 探针特异性的结合，才能检测到阳性扩增信号，使检测结果更特异性，被广泛应用于动物传染病学检测领域。此外，不同荧光报告基团(Reporter，R)标记，可同时对多个样本(尤其针对样品难以获取或病原载量较低样本)开展多种病原学检测，具有高通量、结果迅速等优点，在新发传染病等领域被广泛使用。

本发明建立的鸽轮状病毒A型荧光探针实时荧光定量PCR方法不仅可用于流行病学检测，还可以用于鸽轮状病毒A型感染程度的精确定量，可有效用于鸽轮状病毒A型致病机制差异研究，本发明可填补国内外相关研究领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸽轮状病毒A型荧光定量PCR检测的引物和探针及其试剂盒。利用本发明的引物和探针建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测57拷贝/μL，该方法不仅可用于流行病学检测，还可以用于鸽轮状病毒A型感染程度的精确定量，可有效用于鸽轮状病毒A型致病机制差异研究，本发明可填补国内外相关研究领域空白。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种鸽轮状病毒A型实时荧光定量PCR检测的引物和探针，所述引物序列如下：

引物PiRVA-TF：5’-CCGAACTGCTCCTGTATGAAT-3’，

引物PiRVA-TR：5’-CATTGCCCATTGCTATCCATTT-3’；

所述探针的序列为：

探针PiRVA-probe：5’-AGTCTGACATCCATTTCATTGCACAACC-3’，且其 5’-端标记荧光报告基团FAM，在探针的中间和3’-端分别标记淬灭基团DBQ1。

所述引物和探针用于鸽轮状病毒A型的实时荧光定量PCR检测方法为：

(1)核酸的制备：

按照核酸提取试剂盒(EasyPure Viral DNA/RNA Kit)的说明书方法进行操作，提取PiRVA病毒的核酸RNA，并反转录成cDNA，放置-20℃保存备用；

(2)阳性标准品的构建

根据鉴定的鸽轮状病毒A型VP7基因序列特点，设计PCR扩增的特异性引物，上游引物PiRVA-F：5’-GCCAACCACATCAGTCTACTTA-3’、下游引物PiRVA-R： 5’-CACGATGCGACTGTATAATTGA-3’，以制备的PiRVA核酸cDNA作为模板，利用上游引物PiRVA-F、下游引物PiRVA-R进行PCR扩增，预期扩增片段大小为 399bp。其中，所述引物在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

使用PCR扩增试剂(2×PCR Master试剂)推荐的50μL体系进行扩增，其中 2×PCRMaster Mix反应液25μL、上/下游引物(PiRVA-F/PiRVA-R)(引物浓度为20μmol·L

PCR反应结束后，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取5个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养 14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物 (PiRVA-F/PiRVA-R)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。经Blast分析后，符合实验预期的阳性重组质粒作为本研究的标准品(P-PiRVA)。利用分光光度计测定其浓度后，计算相应的拷贝数为5.7×10

(3)TaqMan探针实时荧光定量PCR反应条件优化：

按照Probe qPCR Mix试剂盒说明书配制20μL的实时荧光定量PCR反应体系，以阳性标准品(P-PiRVA)为模板，在不同退火温度(56～63℃)、引物 (PiRVA-TF、PiRVA-TR)浓度(2～20μmol/L)、探针PiRVA-probe浓度(2～ 20μmol/L)下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。

引物浓度优化：将上游引物PiRVA-TF以及下游引物PiRVA-TR的浓度均倍比稀释为2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、20μmol/L再分别进行检测，通过试验结果的分析比较，确定上游引物PiRVA-TR与下游引物PiRVA-TR 的最佳浓度为10μmol/L。

探针浓度优化：将探针PiRVA-probe的浓度倍比稀释为2μmol/L、4.0μmol/L、 8μmol/L、10μmol/L、20μmol/L再分别进行检测，通过试验结果的分析比较，确定探针PiRVA-probe的最佳浓度为10μmol/L。

退火和延伸温度进行优化时，所选的退火和延伸温度为56℃、57℃、58℃、 59℃、60℃、61℃、62℃以及63℃，通过试验结果的分析比较，确定最优的退火和延伸温度均为58℃。

通过上述优化方法：筛选出的最佳反应体系为：Probe qPCR Mix(2×)混合液10μL、上/下游引物(PiRVA-TF和PiRVA-TR)(10μmol/L)各0.4μL、探针 (PiRVA-probe)(10μmol/L)0.8μL、模板1μL、水(Nuclease-free Water)补足至20μL。

优化后的最佳反应条件为：95℃预变性120s；95℃10s、58℃30s，共40 个循环。

(4)TaqMan探针实时荧光定量标准曲线的建立

用优化后的TaqMan探针实时荧光定量PCR反应条件，以含量为5.7×10

用优化后的TaqMan探针实时荧光定量PCR反应条件，分别以含量为5.7×10

本发明还提供所述的引物(PiRVA-TF、PiRVA-TR)和探针(PiRVA-probe) 在制备鸽轮状病毒A型特异性检测试剂盒中的应用。

本发明还提供一种鸽轮状病毒A型实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物(PiRVA-TF、PiRVA-TR)和探针(PiRVA-probe)。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

1.检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。

2.定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中的Ct 值，直接对鸽轮状病毒A型感染给出判定，并可对其感染程度进行准确定量。

3.灵敏度高：最低可检测57拷贝/μL。

4.特异性强：与鸽群中常见的病原鸽腺病毒B型(PiAdVB)、鸽圆环病毒 (PiCV)、鸽副黏病毒(PiNDV)、鸽疱疹病毒(PiHV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)均无反应信号，仅对鸽轮状病毒A型检测出现荧光信号。

5.重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法进行PiRVA检测的组内变异系数为0.27％-1.50％，组间变异系数0.24％-1.68％，表明本发明建立的实时定量 PCR方法重复性好。

附图说明

图1 TaqMan探针实时荧光定量PCR检测PiRVA标准曲线。

图2 TaqMan探针实时荧光定量PCR检测PiRVA敏感性试验结果图。其中，1 为模板浓度5.7×10

图3 TaqMan探针实时荧光定量PCR检测PiRVA特异性试验结果图，其中，1 为PiRVA；C为对照样品(PiAdVB、PiCV、PiNDV、PiHV、H9 AIV)，由于均无荧光信号，肉眼无法区分。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

实施例1

1.相关试验病原

试验用病原鸽轮状病毒A型(PiRVA)、鸽腺病毒B型(PiAdVB)、鸽圆环病毒(PiCV)、鸽副黏病毒(PiNDV)、鸽疱疹病毒(PiHV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

2.核酸的制备

用北京全式金生物技术有限公司核酸提取试剂盒(EasyPure Viral DNA/RNAKit)按照说明书方法进行操作提取病毒的核酸DNA(PiCV、PiAdVB、PiHV，无需进行反转录)或核酸RNA(PiRVA、PiNDV、H9 AIV，需要反转录成cDNA)，均放置-20℃保存备用。

3.TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的引物和探针设计

根据GenBank中登录的所有鸽轮状病毒A型的基因序列，并进行全基因的比较分析，最终选择鸽轮状病毒A型的VP7基因设计特异性的引物和探针，序列为：

引物PiRVA-TF(SEQ ID NO.1)：5’-CCGAACTGCTCCTGTATGAAT-3’，

引物PiRVA-TR(SEQ ID NO.2)：5’-CATTGCCCATTGCTATCCATTT-3’；

探针PiRVA-probe(SEQ ID NO.3)：

5’-AGTCTGACATCCATTTCATTGCACAACC-3’

其中，探针PiRVA-probe(SEQ ID NO.3)其5’-端标记荧光报告基团FAM，在探针的中间和3’-端分别标记淬灭基团DBQ1，即探针标记两个DBQ1淬灭基团；

引物和探针均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

4.阳性标准品的构建

根据鉴定的鸽轮状病毒A型VP7基因序列特点，设计PCR扩增的特异性引物，上游引物PiRVA-F：5’-GCCAACCACATCAGTCTACTTA-3’、下游引物PiRVA-R： 5’-CACGATGCGACTGTATAATTGA-3’，预期扩增片段大小为399bp。

使用PCR扩增试剂(2×PCR Master试剂)推荐的50μL体系进行扩增，其中 2×PCRMaster Mix反应液25μL、上/下游引物(PiRVA-F/PiRVA-R)(引物浓度为20μmol·L

PCR反应结束后，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取5个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养 14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物 (PiRVA-F/PiRVA-R)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。经Blast分析后，符合实验预期的阳性重组质粒作为本研究的标准品(P-PiRVA)。利用分光光度计测定其浓度后，计算相应的拷贝数为5.7×10

5鸽轮状病毒A型TaqMan探针实时荧光定量PCR特异性检测方法的建立

5.1 TaqMan探针实时荧光定量PCR反应条件优化

按照Probe qPCR Mix试剂盒说明书配制20μL的实时荧光定量PCR反应体系，以阳性标准品(P-PiRVA)为模板，在不同退火温度(56～63℃)、引物 (PiRVA-TF、PiRVA-TR)浓度(2～20μmol/L)、探针PiRVA-probe浓度(2～20μmol/L)下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。

引物浓度优化：将上游引物PiRVA-TF以及下游引物PiRVA-TR的浓度均倍比稀释为2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、20μmol/L再分别进行检测，通过试验结果的分析比较，确定上游引物PiRVA-TR与下游引物PiRVA-TR 的最佳浓度为10μmol/L。

探针浓度优化：将探针PiRVA-probe的浓度倍比稀释为2μmol/L、4.0μmol/L、 8μmol/L、10μmol/L、20μmol/L再分别进行检测，通过试验结果的分析比较，确定探针PiRVA-probe的最佳浓度为10μmol/L。

退火和延伸温度进行优化时，所选的退火和延伸温度为56℃、57℃、58℃、 59℃、60℃、61℃、62℃以及63℃，通过试验结果的分析比较，确定最优的退火和延伸温度均为58℃。

通过上述优化方法：筛选出的最佳反应体系为：Probe qPCR Mix(2×)混合液10μL、上/下游引物(PiRVA-TF和PiRVA-TR)(10μmol/L)各0.4μL、探针 (PiRVA-probe)(10μmol/L)0.8μL、模板1μL、水(Nuclease-free Water)补足至20μL。

优化后的最佳反应条件为：95℃预变性120s；95℃10s、58℃30s，共40 个循环。

5.2 TaqMan探针实时荧光定量标准曲线的建立

分别以标准品(P-PiRVA)含量为5.7×10

5.3 TaqMan探针实时荧光定量PCR的敏感性试验

分别以标准品(P-PiRVA)含量为5.7×10

5.4 TaqMan探针实时荧光定量PCR的特异性试验

用建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法，分别对PiRVA、PiAdV-B、 PiCV、PiNDV、PiHV、H9 AIV进行检测。结果可见，仅对PiRVA出现阳性扩增信号，对PiAdVB、PiCV、PiNDV、PiHV、H9 AIV均未见阳性扩增信号(图3)。

5.5 TaqMan探针实时荧光定量PCR重复性试验

用建立的实时荧光定量PCR方法分别对质粒含量为5.7×10

6临床应用

使用建立的鸽轮状病毒A型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，对 41份临床送检鸽源病料进行检测，结果显示：FAM通道出现荧光信号阳性样品 8份(Ct值为21.01、26.90、21.80、22.49、19.76、20.61、22.57和24.45)，表明为鸽轮状病毒A型阳性，阳性率为19.5％(8/41)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种鸽轮状病毒A型荧光定量PCR检测的引物和探针及其试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgaactgct cctgtatgaa t 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cattgcccat tgctatccat tt 22

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtctgacat ccatttcatt gcacaacc 28