长牡蛎高温响应基因HSP70表达调控SNP标记及其应用

摘要

本发明属于基因工程与遗传育种领域，具体涉及长牡蛎高温响应基因HSP70表达调控SNP标记及其在鉴定高温耐受牡蛎个体中的应用。SNP标记为SEQ ID NO:2所示序列中第251位碱基，突变类型为C/G(反式调控位点Marker13973)。本发明提供了一个与HSP70基因表达显著相关的SNP标记，其优势在于可以在苗种繁育前对亲贝基因型进行鉴定，提高子代对高温环境的耐受。本研究获得的SNP标记可信度高，结果稳定。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程与遗传育种领域，涉及长牡蛎高温响应基因 HSP70表达调控SNP标记及其应用和鉴定耐高温牡蛎个体的方法。

背景技术

双壳贝类软体动物由于其分布广泛且具有重要生态意义，长期以来一直被视为监测海洋生境污染和全球变暖影响的良好生物学指标。牡蛎作为双壳贝类及冠轮动物乃至海洋无脊椎生物中的模式物种，是研究气候变化对于沿海生态系统影响的绝佳选择。牡蛎是全球贸易量最大的养殖贝类，年贸易额逾10亿美元，牡蛎也是我国主养贝类，年产量占海水养殖产量的 25％(图3)，产值逾400亿元(2019年中国渔业统计年鉴)。但是很长一段时间以来，在全球范围内频繁出现的周期性夏季大规模死亡给许多国家造成严重的经济损失。研究表明，许多非生物因素如温度水质和盐等本身或者与其他生物因素如病毒等一起造成牡蛎的大规模死亡。而高温被认为是导致牡蛎夏季死亡的最重要的非生物因素之一。因此了解牡蛎高温调控机制和如何提高牡蛎抗高温能力成为产业亟待解决的问题。

长牡蛎(Crassostrea gigas)主要分布在我国长江以北，福建牡蛎 (Crassostreaangulata)分布在长江以南，是两个异域分布的姊妹亚种，系统发育分析显示他们的分化时间约为2.7Ma。二者的栖息地环境存在巨大差异，尤其是年均海水表层温度差异可达6.6℃，年平均气温差异高达 8.7℃。两者在纬度分布上的差异揭示了二者在温度适应上的差异性。福建牡蛎具有更高的热胁迫存活率、阿伦尼乌斯温度和Q

研究表明生物体应对高温胁迫响应的基因主要是参与细胞稳态和能量平衡的基因。由转录组数据显示热休克蛋白基因长牡蛎和福建牡蛎中分化显著，在高温胁迫下福建牡蛎HSP70基因的诱导型表达显著高于长牡蛎，说明该基因的表达与牡蛎的高温耐受性密切相关，可以作为牡蛎高温耐受性的一个重要分子表型，但是哪种表型有显著是目前比较关注重点。

发明内容：

本发明的目的是找到潜在调控高温响应基因表达的SNP位点，并为长牡蛎的分子标记辅助选择提供参考。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种长牡蛎高温响应基因HSP70表达调控SNP标记，SNP标记为 SEQ ID NO:2所示序列中第251位碱基，突变类型为C/G(反式调控位点Marker13973)。

所述基因型为纯合或杂合，即基因型为CC或CG。

一种用于检测SNP标记的引物组，所述引物组为特异外围扩增引物和单碱基延伸引物基因序列，

特异外围扩增引物为

Marker13973-F：5’-TACATTAACTGTAAATTAATTCAACTTT-3’；

Marker13973-R：5’-TCTTAAAAAAGTAGAGAAAAATATGAA-3’；

和下述单碱基延伸引物基因序列，

Marker13973:

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGCAGTACATTTCATCATTTG- 3’。

一种用于检测所述的SNP标记的试剂盒，包含所述的引物组。

SNP标记、引物组或试剂盒在鉴别高温耐受牡蛎个体中的应用。

一种鉴定高温耐受牡蛎个体的方法，通过对待测牡蛎进行SNP标记的检测，而后确定待测牡蛎的基因型，而后根据基因型确定高温耐受牡蛎的优势个体。

具体为：提取待测牡蛎的基因组DNA；利用所述的引物组，以待测牡蛎的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，扩增包含目标SNP位点的片段，而后利用单碱基引物对SNP位点进行分型检测，进而鉴定待检测牡蛎的基因型，确定高温耐受牡蛎个体。

所述确定待检测牡蛎的SNP位点并进行分型检测：a.提取的DNA 样品稀释至20ng/μl后作为PCR模板，利用特异引物，进行外围扩增；外围引物序列为：

Marker13973-F：5’-TACATTAACTGTAAATTAATTCAACTTT-3’；

Marker13973-R：5’-TCTTAAAAAAGTAGAGAAAAATATGAA-3’；

PCR反应体系：

PCR扩增的反应程序为：

b.SNaPshot PCR:以PCR产物作为SNaPshot PCR的模板，产物纯化后，进行位点的检测，其中，单碱基特异性引物序列为：

Marker13973:

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGCAGTACATTTCATCAT TTG-3’；

反应体系：

反应程序：

c.利用上述扩增产物鉴定每个个体的基因型。

本发明的优点：

本发明通过检测个体基因型的方法预测牡蛎个体高温响应基因的表达高低，可快速大批量筛选不同表达水平牡蛎个体，鉴定抗高温牡蛎，且可应用于育种中通过无损取样技术在繁育前检测亲本基因型，并选择目标基因型组合个体作为亲本，进行分子标记辅助选择育种，繁育抗高温的子代，也能作为预测当今全球变暖的环境背景下牡蛎适应潜力的潜在标记。

本发明通过对牡蛎高温响应的重要基因HSP70进行eQTL分析，定位到一个重要的高温响应HSP70的上游调控位点：Marker13973，且Marker13973 标记下游2kb左右有一个核小体蛋白基因RPL10A，已有研究报道该基因可以促进HSP70基因的表达；并获得其最佳基因型组合，将其基因型用于高温响应基因不同表达水平的个体的预测。本发明的候选标记经简化基因组获得，由eQTL定位得到，进一步针对单位点经其他群体验证，结果可靠，可用于HSP70基因不同表达水平个体的筛选，鉴定耐高温牡蛎亲本，繁育抗高温牡蛎个体，也可以预测牡蛎环境适应的潜力；

进而采用本发明方法可以快速大批量筛选不同表达水平的牡蛎个体，且可以在繁育前对亲贝进行基因型鉴定，筛选抗高温的牡蛎亲本，提高子代抗高温能力，还能预测当今气候变化下牡蛎的适应潜力。本发明的结果可靠，获得的SNP位点可信度高，效果稳定。

附图说明

图1是ZF2-3家系106个牡蛎个体的HSP70基因表达量频率分布直方图。

图2是HSP70基因eQTL定位图。

图3为HSP70基因表达水平和调控位点Marker13973基因型的关联图。

1.SEQ ID NO:1为长牡蛎HSP70基因全序列，信息序列特征长度： 2111bp，基因ID：CGI_10016162。

2.SEQ ID NO:2为调控HSP70表达的SNP标记序列，信息序列特征长度：501bp，scaffold41136,3037位点上下游250bp。

具体实施方式：

以下结合实施例来进一步阐释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

利用实验室前期构建的一张高密度遗传图谱，通过对构建图谱的106 个长牡蛎和福建牡蛎拟回交F2(ZF2-3)子代个体进行高温响应候选基因HSP70表达水平测定，进而进行eQTL连锁定位，对于定位到的候选调控SNP位点，在另一长牡蛎和福建牡蛎回交家系中关联分析验证结果。

上述的高密度遗传图谱，上图标记为1,694个，标记间平均距离为 0.8cM，基因组覆盖度为98.7％。

在作图的长牡蛎和福建牡蛎拟回交F2代家系(ZF2-3)106子代个体中检测每个个体HSP70基因的表达量，通过基因型和基因表达的连锁定位分析，定位到一些反式调控位点(trans-eQTLs)。经另一长牡蛎和福建牡蛎拟回交F2代家系ZF95个子代个体中做关联分析验证：得到 Marker13973位点与HSP70基因的表达显著相关(p<0.05)，可用于筛选耐高温牡蛎个体。

与高温响应基因表达相关的SNP标记筛选步骤是：

实验材料的构建：收集长牡蛎和福建牡蛎野生个体，构建两个长牡蛎和福建牡蛎拟回交F2代家系ZF2-3：父本是长牡蛎和福建牡蛎子一代个体，母本为采集于青岛的野生长牡蛎。

基因分型：采用精简基因组(GBS)对其中一个拟回交家系106个子代个体进行全基因组分型，并构建高密度遗传图谱；

基因表达量的测定：qRT-PCR法测定HSP70基因表达量。

eQTL连锁分析：利用MapQTL6软件通过区间作图法和多重QTL定位法进行连锁定位，eQTL定位图见附图2，得到HSP70基因的一个候选反式调控位点Marker13973。

由上述可获得牡蛎高温响应基因：热休克蛋白基因HSP70。通过表达数量性状定位(eQTL)鉴定出HSP70基因的一个表达调控位点 Marker13973，并在另一独立群体ZF中通过关联分析进一步验证了这个位点与HSP70基因表达的相关性。针对这个SNP位点，开发了一种快速检测基因型的方法。Marker13973位点的优势基因型(CG)比劣势基因型(CC)HSP70基因的表达量高54.4％。；后续可以通过鉴定牡蛎个体的基因型筛选高温响应HSP70基因不同表达水平的个体，进而筛选耐高温的牡蛎亲本，用于牡蛎育种，除此之外也为预测当今严峻的全球气候变化下海洋生物的适应潜力提供基础研究。本发明提供了一个与HSP70基因表达显著相关的SNP标记，其优势在于可以在苗种繁育前对亲贝基因型进行鉴定，提高子代对高温环境的耐受。本研究获得的SNP标记可信度高，结果稳定。

实施例1：

与高温响应基因表达相关的SNP标记筛选步骤是：

A)实验材料的构建：收集长牡蛎和福建牡蛎野生个体，构建两个长牡蛎和福建牡蛎拟回交F2代家系ZF2-3：父本是长牡蛎和福建牡蛎子一代个体，母本为采集于青岛的野生长牡蛎。

B)基因分型：采用精简基因组(GBS)对该家系106个子代个体进行全基因组分型，并构建高密度遗传图谱。详细步骤请参考Wang等的文章 (Wang et al.2016)。

1.限制性内切酶双酶切2.设计接头及barcode 3.接头退火4.构建测序文库5.文库质检和上机测序6.利用Stack软件对原始Reads进行 SNP分型7.利用JoinMap 4.0构建遗传图谱。

C)基因表达量的测定：qRT-PCR法测定HSP70基因表达量，ZF2-3家系106个牡蛎个体HSP70基因表达量频率分布直方图见图1。

D)eQTL连锁分析：利用MapQTL6软件通过区间作图法和多重QTL定位法相结合进行连锁定位依据区间作图法选择辅因子，并多次选择辅因子进行多重QTL定位，直至得到稳定的结果。置换检验3000次得到LOD阈值，超过染色体水平的阈值的位点被认为是与目的基因表达显著相关的调控位点，得到HSP70基因的候选反式调控位点Marker13973。eQTL定位图见附图2。

实施例2

利用上述获得位点验证其与HSP70基因表达相关：

A)实验样品的预处理：取长牡蛎和福建牡蛎拟回交F2代家系ZF子代95个个体,父本是长牡蛎和福建牡蛎子一代个体，母本为采集于青岛的野生长牡蛎。分成单体清洗干净后置于35℃海水中应激，3小时后取鳃组织于液氮速存，后置于-80℃保存备用。

B)DNA的提取：按照天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的说明书提取95个牡蛎个体的DNA。Nanodrop 2000分光光度计测定DNA浓度。采用1.0％凝胶电泳法进行质量鉴定。

C)基因分型：采用SNaPshot(多重单碱基延伸技术)检测每个个体目标位点(Marker13973)基因型。

用上述提取的DNA模板，通过外围引物扩增出目的片段，进而对得到的PCR产物采用特异性的单碱基引物进行SNaPshot PCR，上机检测目标位点基因型。

1)采用特异性外围引物对该SNP位点外围扩增：

模板：提取的DNA样品稀释至20ng/μl后作为PCR模板；

引物序列：

Marker13973-F：5’-TACATTAACTGTAAATTAATTCAACTTT-3’；

Marker13973-R：5’-TCTTAAAAAAGTAGAGAAAAATATGAA-3’；

反应体系：

反应程序：

2)采用特异性引物对该SNP位点进行检测：

SNaPshot PCR：在该反应体系中，引物延伸一个碱基即终止。

模板：上述PCR产物纯化后用作SNaPshot PCR的反应模板。

单碱基延伸引物序列：

Marker13973:

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGCAGTACATTTCATCATT TG-3’；

单碱基延伸引物稀释到10μM，将各位点的等体积单碱基延伸引物混合，得到Pooled Primers，进行SNaPshot PCR；

PCR体系及各组分如下：

反应程序：

而后对上述扩增产物经3730测序仪毛细血管电泳，鉴定每个个体在这个标记(Marker13973)的基因型，具体为：

按照上述体系依次加入各组分后，95℃加热预变性5分钟，-20℃冷却后上3730测序仪进行毛细管电泳检测。结果用Gene mapper 4.1软件进行准确位点数据分析，分析数据按照SNP位点对应峰的情况进行基因分型，分型结果见表1。

表1

D)RNA的提取：使用天根RNAprep pure Tissue Kit试剂盒提取RNA. Nanodrop2000分光光度计测定DNA浓度。采用1.0％凝胶电泳法进行质量鉴定。反转录得到cDNA用于后续定量实验。

E)定量PCR：针对HSP70基因的序列设计定量PCR引物，使用日本 TaKaRa公司SYBR荧光定量试剂盒进行实验，引物序列：

HSP70-F：5‘-TCACTCCGCTGTCGTTGGGTAT-3’

HSP70-R：5‘-TGTCCATCAGCAGCCGTTGAGA-3’

反应体系：

反应程序：

长牡蛎延伸因子elongation factor(CgEF)作为内参基因，基因表达水平通过内参进行归一，然后利用2

表2

E)关联分析：将95个牡蛎个体在Marker13973位点基因分型数据和 HSP70基因表达数据导入Graph Primer软件进行关联分析， Mann-Whitney检验结果(参见表3和图2)。

表3为HSP70基因的表达量

由表1和图2可见显示：Marker13973位点与HSP70基因的表达显著相关。(p<0.05)，HSP70基因的表达量：CG>CC；后续可以通过筛选个体基因型(CG)，选择HSP70基因高表达的牡蛎个体。

实施例3

利用上述获得Marker13973调控位点与HSP70基因的表达显著相关，进一步验证这个标记基因型与高温耐受性之间的关系：

对上述Marker13973位点在福建牡蛎(高温耐受)和长牡蛎(高温敏感) 验证其与高温耐受的关系：

A)实验样品的准备：分别在厦门和青岛采集野生福建牡蛎和长牡蛎个体各 50只用于后续实验。

B)DNA的提取：采用按照天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的说明书提取这100个牡蛎个体的DNA。Nanodrop 2000分光光度计测定DNA 浓度。采用1.0％凝胶电泳法进行质量鉴定。

C)基因分型：采用SNaPshot(多重单碱基延伸技术)检测每个个体目标位点(Marker13973)基因型。

D差异分析：采用卡方检验的分析方法，检验这个位点的基因型在长牡蛎和福建牡蛎中的差异，进而构建基因型与高温耐受性的关联。结果显示 Marker13973这个位点的基因型频率在长牡蛎和福建牡蛎中差异显著。

由上述可见，可通过本发明SNP标记鉴定牡蛎个体的基因型筛选高温响应HSP70不同表达水平的个体，进而筛选耐高温的牡蛎亲本，用于牡蛎育种，除此之外也为预测当今严峻的全球气候变化下海洋生物的适应潜力提供基础研究。本发明提供了一个与HSP70基因表达显著相关的 SNP标记，其优势在于可以在苗种繁育前对亲贝基因型进行鉴定，提高子代对高温环境的耐受。本研究获得的SNP标记可信度高，结果稳定。

序列表(1)NO.1的信息序列特征长度：2111bp

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：

分子类型：DNA

来源：长牡蛎

序列描述：

ATGTACACTGTACAGGGAATGCTGGGACAGGGTATCCTGGGACGGAGTCAGA ACCAATCAGATTACTGTAATCTTGACCCGGGTTGCAGAATTCAGAATGTACGA AATCTGCACGCCAAATCAATGAAGAAACAGATTCCCTTGCTGACCCTAAATGG AAGTCAGTCAATACAGAAGAGAAACAACAGTTCTGGAAAAGTTAAAGGTCAA GTGATTGGAATAGATTTGGGAACAACAAATTATGTGTAGCTGTAATGGAAGGA AAAACTCCCAAAGTTCTGGAAAATTCTGAGGGATCAAGAACAACCCCTTCTGT CGTGGCGTTCACCAAGGATGGAGAGCGCTTAGTGGGGATGCCTGCCAAAAGA CAGGCCGTCACCAATGCAGAAAACACATTCTCTGCAACAAAACGTTTGATTGG TCGCCGTTTTGAGGATGCTGAAGTCCAGAAAGACATGAAGACTGCTTCCTTTA AGATTGTAAAGGCCACCAATGGTGATGCATGGGTAGAGGCTCATGGAAAGAT GTATTCCCCTAGTCAAATCGGTGCATTCGTCTTAATGAAAATGAAGGAGACAG CTGACAATTACCTCGGACAGAAGGTCAAGAACGCAGTCATCACAGTTCCAGCT TATTTCAATGACTCTCAGAGACAGGCCACAAAGGATGCTGGTCAAATTTCTGG ATTAAACGTGCTGCGAGTCATCAATGAACCAACAGCTGCCGCTCTGGCCTATGGCATGGACAAGACGGACGACAAGCTCATTGCTGTATATGATTTGGGAGGTGG AACTTTCGACATTTCTATTCTGGAGATGCAGAGGGGCGTGTTTGAGGTGAAAT CAACTAATGGGGACACTTTCCTTGGTGGTGAGGATTTCGACAATGCCTTGGTC ACATTTTTGGCCAATGAATTCAAACGTGATCAAGGGCTCGATGTAACCAAAGA CAACATGGCTATGCAGAGATTGAGAGAAGCAGCAGAGAAAGCCAAGATAGAG CTCTCATCAAGCATGCAGACTGACATCAACCTCCCCTACCTGACAATGGATGC CACAGGACCCAAACACATGAACATGAAACTGACCCGAGCCAAGTTTGAGGGG ATTGTGGAGAGCTTGGTGAAGCGTACGGTCGGACCGTGTCAGAAGGCTATGA GTGATGCCGAGGTCAAGAAGTCCGACATTGGCGATGTCATCCTTGTAGGAGGA ATGACTCGTATGCCCAGGGTGCAAGCATTGGTACAGGAAGTATTTGGTAGAGC ACCAGGAAAGTCGGTCAATCCGGATGAAGCTGTTGCCATGGGAGCAGCCATTC AGGGAGGAGTTTTGGCAGGAGACGTAACTGATGTCCTTCTGTTGGACGTCACT CCGCTGTCGTTGGGTATTGAGACTCTTGGAGGCGTGTTCACAAAACTGATTGA CAGAAATACCACCATCCCCACAAAGAAATCTCAGGTTTTCTCAACGGCTGCTG ATGGACAAACCAGTGTGGAGATCAAAGTTTGTCAAGGGGAGAGAGAGATGGC CGCCGACAACAAGCTCCTCGGCCAGTTTATGTTGGTTGGAATTCCCCCTGCCC CTCGTGGAGTCCCTCAAGTTGAAGTGACTTTTGACATTGACGCTAACGGCATTGTAAATGTATCTGCTAGAGACAAGGGAACTGGAAAAGAACAGCAAATCGTGA TCCAGAGTTCTGGAGGTCTTAGCAAGGAGGAGATTGAGAACATGGTGAAGAA CGCAGAGAAGTACGCTGCTGAGGACCATGTCAGAAAGGAAAGAGTAGAGGCA GTAAACCAAGCCGATGCTATTATTCACGACACAGAATCCAAACTGGAAGAATT CAAGAGCCAACTCCCAGAGGAGGATGCCAATAAACTGCGGGAACAAATTGCC GGAGTGAAGGAGCTGATCGCCAAGAAGGACCAAGTAGAAGTAGAGGAGCTG AAACAGGCGACCTCTAACATGCAGCAGGCCTCCCTCAAAGTGTTCGAGCTGGC TTACAAAAAGATGTCTGCTGACAGGGAAAGTCAGAGCGGATCCTCATCAAGT GAAGACAGTGGCTCATCAGAATCTAAAGACGAACAGGAAAAGAAGGAGGAG AAGAACTGA

序列表(1)NO.2的信息序列特征

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：

分子类型：DNA

来源：长牡蛎

序列描述：

AAATAATAATGATGATGTCAGACTCAAACTCCACTTTGAGACAATTTGTTTCTT TCTTTTATCCAACGACTGAAGTACATTAACTGTAAATTAATTCAACTTTATATA GGACACAAAAACACTTAAAACCAACATGTTCTCAAATATCAGTATACCTTGTA TTCCTACGCACTATGAACTTGCGCGAGAGTTGGTGCAACGTAACAGCGCCACA GCCAGCGCGAAATCACTGCGCGTAAAAATAATATAACCAAATGATGAAATGT ACTGCATGTTATGTACTATAATTAATGAATTCTCATGAAATCTACACCAACAA GTATTATTCCATTTTATTTGTATTTCATAAATGTATAATTGTTCATATTTTTCTC TACTTTTTTAAGAGGCTGACCTTCACAAGCTTTTATAAGAAATATAGATTCACA AGGCAGTTCTAACACCTTCTGTTTTATTTTTTTTCCCTTTGTACAGAGATAAAC TCTTTGGAGGGGGGGGGGG 。

序列表

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 长牡蛎高温响应基因HSP70表达调控SNP标记及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2111

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtacactg tacagggaat gctgggacag ggtatcctgg gacggagtca gaaccaatca 60

gattactgta atcttgaccc gggttgcaga attcagaatg tacgaaatct gcacgccaaa 120

tcaatgaaga aacagattcc cttgctgacc ctaaatggaa gtcagtcaat acagaagaga 180

aacaacagtt ctggaaaagt taaaggtcaa gtgattggaa tagatttggg aacaacaaat 240

tatgtgtagc tgtaatggaa ggaaaaactc ccaaagttct ggaaaattct gagggatcaa 300

gaacaacccc ttctgtcgtg gcgttcacca aggatggaga gcgcttagtg gggatgcctg 360

ccaaaagaca ggccgtcacc aatgcagaaa acacattctc tgcaacaaaa cgtttgattg 420

gtcgccgttt tgaggatgct gaagtccaga aagacatgaa gactgcttcc tttaagattg 480

taaaggccac caatggtgat gcatgggtag aggctcatgg aaagatgtat tcccctagtc 540

aaatcggtgc attcgtctta atgaaaatga aggagacagc tgacaattac ctcggacaga 600

aggtcaagaa cgcagtcatc acagttccag cttatttcaa tgactctcag agacaggcca 660

caaaggatgc tggtcaaatt tctggattaa acgtgctgcg agtcatcaat gaaccaacag 720

ctgccgctct ggcctatggc atggacaaga cggacgacaa gctcattgct gtatatgatt 780

tgggaggtgg aactttcgac atttctattc tggagatgca gaggggcgtg tttgaggtga 840

aatcaactaa tggggacact ttccttggtg gtgaggattt cgacaatgcc ttggtcacat 900

ttttggccaa tgaattcaaa cgtgatcaag ggctcgatgt aaccaaagac aacatggcta 960

tgcagagatt gagagaagca gcagagaaag ccaagataga gctctcatca agcatgcaga 1020

ctgacatcaa cctcccctac ctgacaatgg atgccacagg acccaaacac atgaacatga 1080

aactgacccg agccaagttt gaggggattg tggagagctt ggtgaagcgt acggtcggac 1140

cgtgtcagaa ggctatgagt gatgccgagg tcaagaagtc cgacattggc gatgtcatcc 1200

ttgtaggagg aatgactcgt atgcccaggg tgcaagcatt ggtacaggaa gtatttggta 1260

gagcaccagg aaagtcggtc aatccggatg aagctgttgc catgggagca gccattcagg 1320

gaggagtttt ggcaggagac gtaactgatg tccttctgtt ggacgtcact ccgctgtcgt 1380

tgggtattga gactcttgga ggcgtgttca caaaactgat tgacagaaat accaccatcc 1440

ccacaaagaa atctcaggtt ttctcaacgg ctgctgatgg acaaaccagt gtggagatca 1500

aagtttgtca aggggagaga gagatggccg ccgacaacaa gctcctcggc cagtttatgt 1560

tggttggaat tccccctgcc cctcgtggag tccctcaagt tgaagtgact tttgacattg 1620

acgctaacgg cattgtaaat gtatctgcta gagacaaggg aactggaaaa gaacagcaaa 1680

tcgtgatcca gagttctgga ggtcttagca aggaggagat tgagaacatg gtgaagaacg 1740

cagagaagta cgctgctgag gaccatgtca gaaaggaaag agtagaggca gtaaaccaag 1800

ccgatgctat tattcacgac acagaatcca aactggaaga attcaagagc caactcccag 1860

aggaggatgc caataaactg cgggaacaaa ttgccggagt gaaggagctg atcgccaaga 1920

aggaccaagt agaagtagag gagctgaaac aggcgacctc taacatgcag caggcctccc 1980

tcaaagtgtt cgagctggct tacaaaaaga tgtctgctga cagggaaagt cagagcggat 2040

cctcatcaag tgaagacagt ggctcatcag aatctaaaga cgaacaggaa aagaaggagg 2100

agaagaactg a 2111

<210> 2

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaataataat gatgatgtca gactcaaact ccactttgag acaatttgtt tctttctttt 60

atccaacgac tgaagtacat taactgtaaa ttaattcaac tttatatagg acacaaaaac 120

acttaaaacc aacatgttct caaatatcag tataccttgt attcctacgc actatgaact 180

tgcgcgagag ttggtgcaac gtaacagcgc cacagccagc gcgaaatcac tgcgcgtaaa 240

aataatataa ccaaatgatg aaatgtactg catgttatgt actataatta atgaattctc 300

atgaaatcta caccaacaag tattattcca ttttatttgt atttcataaa tgtataattg 360

ttcatatttt tctctacttt tttaagaggc tgaccttcac aagcttttat aagaaatata 420

gattcacaag gcagttctaa caccttctgt tttatttttt ttccctttgt acagagataa 480

actctttgga gggggggggg g 501