GSS1蛋白质作为小菜蛾口腔分泌蛋白的内参蛋白的应用

摘要

本发明公开了GSS1蛋白质作为小菜蛾口腔分泌蛋白的内参蛋白的应用。本发明的优点在于在小菜蛾不同组织中能够广泛检测到GSS1存在，尤其在口腔分泌物中能够稳定检测且不受到底物硫苷的诱导的特性，可作为小菜蛾口腔分泌总蛋白和特定分泌蛋白定量的内参蛋白，能够很好的服务于该昆虫的口腔分泌蛋白的定量。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及GSS1蛋白质作为小菜蛾口腔分泌蛋白的内参蛋白的应用。

背景技术

昆虫在取食过程中能够释放大量被植物感知的口腔分泌蛋白(oral secretion，OS)，这些口腔分泌蛋白与植物体内重要基因编码的蛋白发生互作，改变植物激素信号通路，从而调控植物的抗虫反应。昆虫口腔分泌蛋白的组成多样且复杂，主要分为两大类，即取食相关分子模式蛋白和效应蛋白。不同口器类型的昆虫其口腔分泌蛋白的组成差异较大。尽管基于质谱等检测手段能够针对收集的昆虫口腔分泌蛋白分析其中的组分和含量。但是，该技术依赖大型设备和专业操作，且适合用于广泛性调查。如何进一步针对特定的目标蛋白进行定量与确证，则需要利用实验室常规的Western Blotting(WB)的检测方式。

WB的检测方式用于蛋白定量具有成本相对较低和操作难度较易的特点。但是，对于提取的不同样本总蛋白之间如何保证上样量的均一性，一个稳定表达的内参蛋白是其中的重要环节。对于昆虫细胞核或者胞浆中特定蛋白的定量，基于细胞骨架结构或者组成蛋白可以选择的内参抗体较多，目前常用的蛋白质内参有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和细胞骨架蛋白actin或tubulin。但是，对于分泌到口腔中的分泌型蛋白，由于常见的内参蛋白无法随之分泌，因此需要探索在口腔分泌蛋白中有效且稳定表达的蛋白作为内参蛋白。通过制备候选内参蛋白所对应的抗体，利用WB技术验证该候选内参蛋白在口腔分泌蛋白中表达的稳定性，从而服务于其它分泌蛋白的定量，是我们理解特定蛋白分泌程度的重要前提和依据，也是开展昆虫与寄主植物互作的重要支撑。

小菜蛾全球分布且专食性为害十字花科作物，对人类农业生产活动带来巨大影响。十字花科植物存在经典的硫苷和黑芥子酶二元防御体系，当植物受到昆虫危害时，底物硫苷和黑芥子酶相遇，产生以氰类物质为代表的一系列有毒物质毒害昆虫。然而，小菜蛾体内富含且稳定表达的硫苷硫酸酯酶系GSSs赋予了小菜蛾广泛为害十字花科植物的能力。其中，作为重复基因的GSS1和GSS2长度相同且蛋白同源性超过96％(因而对应抗体无法区分GSS1和GSS2)。但是，关于小菜蛾口腔分泌蛋白中是否含有GSS1和GSS2且是否适用于其它口腔分泌蛋白的定量，目前尚未报道。

发明内容

为解决现有技术缺乏小菜蛾口腔分泌蛋白的内参蛋白的问题，本发明提出GSS1蛋白质作为小菜蛾口腔分泌蛋白的内参蛋白的应用。

为实现上述目的，本发明首先利用已制备的GSS1和GSS2通用抗体，检测昆虫内源的GSS1和GSS2蛋白在不同材料样本中的表达特性。联合利用了WB和免疫组化技术。WB的结果表明GSS1和GSS2蛋白在幼虫期，尤其是3和4龄幼虫期(L3和L4)高度表达。幼虫中，除了在组织中，例如唾液腺(Sag)，前肠(Fg)，中肠(Mg)和后肠(Hg)高量表达外，在分泌物中同样明显存在，包括血淋巴(Hl)和肠道内容物(Gc)(图1)。其次，免疫组化的结果同样证实GSS1和GSS2蛋白在血淋巴(Hl)和肠道内容物(Gc)和相关组织中广泛存在(图2)。此外，为了验证GSS1和GSS2是否存在与小菜蛾口腔分泌蛋白中且能自然状态下释放，我们将取食后的拟南芥叶片进行GSS1和GSS2蛋白的原位检测实验。结果表明，相比被锡箔纸包裹的半片叶片(CK)，另一半叶片的伤口部位(Attack)和叶脉处能够明显检测到GSS1/2的信号(图3)。

由于GSS1和GSS2之间存在序列高同源的特性，抗体无法区分两者在口腔分泌物中存在的比例。因此，本研究利用常规基因编辑技术——CRISPR/Cas9，分别构建获得了GSS1

本发明进一步验证了GSS1蛋白是否会受到底物诱导表达。因为一个内参抗体的选用，其对应的蛋白表达应该是在绝大多数情况下稳定表达。因此，利用不同类型的硫苷涂抹人工饲料喂食小菜蛾。包括从商品化购买的GSS1特异性底物硫苷sinigrin(20μM)和拟南芥提取的总硫苷(850μM)。两种处理的时间皆为3龄幼虫开始(0h)至4龄末期(结蛹之前，即12h和24h)，其GSS1的含量都无显著变化(图5)。这些实验说明GSS1蛋白在幼虫体内呈现稳定表达且不影响其正常的口腔分泌量。

为了验证GSS1蛋白能否应用于小菜蛾特定口腔分泌蛋白的定量，我们利用WB技术，以鳞翅目昆虫中被报道的口腔分泌蛋白葡萄糖氧化酶(GOX)为对象进行定量。WB的结果表明，在收集的3个重复中的小菜蛾口腔分泌蛋白样本中(OS#1-3)，GOX都存在明显信号。通过对图片进行灰度扫描，转换为数值后，揭示GOX相对GSS1的蛋白表达量在0.4左右，说明GSS1能够有效应用于口腔蛋白定量和分析。

本发明的优点在于利用GSS1在不同组织广泛分布，尤其在口腔分泌物中能够稳定检测且不受到底物硫苷的诱导的特性，可作为小菜蛾口腔分泌总蛋白和特定分泌蛋白定量的内参蛋白，能够很好的服务于该昆虫的口腔分泌蛋白的定量。

附图说明

图1为基于WB技术检测昆虫内源GSS1和GSS2蛋白的表达特性；E：卵；L1-4：1-4龄期的小菜蛾幼虫；P：蛹；A：成虫；Sag：唾液腺；Sg：丝腺；Fg：前肠；Mg：中肠；Hg：后肠；Mt：马氏管；Rb：剩余残体；Hl：血淋巴；Gc：肠道内容物；

图2为基于免疫荧光技术检测昆虫内源GSS1和GSS2蛋白的表达特性；Hd：头；Gc：肠道内容物：Hl：血淋巴；Ec：肠道上皮细胞；

图3为基于蛋白原位检测技术检测GSS1和GSS2存在于口腔分泌蛋白；CK：机械损伤(人为制造伤口)；attack：小菜蛾幼虫取食；

图4为基于不同突变体小菜蛾检测口腔GSS1的释放；WT：野生型小菜蛾；GSS1

图5为基于WB技术检测GSS1不受底物硫苷诱导表达；CK-0h：不含硫苷物质的人工饲料喂食的3龄小菜蛾幼虫；CK-12h和CK-24h：不含硫苷物质的人工饲料喂食3龄小菜蛾幼虫12h和24h后的幼虫样本；Sin-12h和Sin-24h，添加20μM sinigrin(A)硫苷的人工饲料喂食3龄小菜蛾幼虫12h和24h后的幼虫样本；Total：添加850μM的拟南芥提取的总硫苷(B)的人工饲料喂食3龄小菜蛾幼虫12h和24h后的幼虫样本；

图6为基于GSS1为内参蛋白定量GOX蛋白含量；A为通过指压法收集4龄幼虫的口腔分泌蛋白，利用WB技术同时检测该样本中的GOX和GSS1的含量，设置3个生物学重复；B为通过image J软件灰度转换成对应数值后，对GOX进行定量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明GSS1蛋白质作为小菜蛾口腔分泌蛋白的内参蛋白的应用作进一步的详细说明。

1、基于WB技术检测昆虫内源GSS1和GSS2蛋白表达特性

相对蛋白表达量是通过image J软件对聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidenefluoride，是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物)上的条带进行定量分析，其中，小菜蛾不同发育阶段和组织的内源总蛋白利用的α-Tubulin作为内参蛋白。

1.1样品收集

虫体样品收集(图1A)：取人工饲料喂食的不同发育阶段的小菜蛾，包括虫卵，四个龄期幼虫，蛹和成虫(每个阶段包括三个生物学重复)；解剖组织样本收集(图1B和C)：以四龄幼虫为解剖样本置于PBS中，利用解剖镊首先在虫体足部开口，后将30只幼虫至于500μL体积的底端开口的离心管中，放置于2mL离心管中，进行500×g离心获得血淋巴。针对幼虫样本，进一步将幼虫腹末端开口选取对应的组织，将马氏管和肠道，并将肠道和其中内容物进行区分，进一步将肠道分解前中后三部分。将虫头部和胸部开口以获得唾液腺和丝腺，将剩余材料统一收集作为剩余残体。

1.2蛋白提取

不同发育阶段和组织的蛋白提取：将步骤1.1备好的样品用液氮进行充分研磨，加入500μL DNA提取酚试剂(索莱宝，北京)和500μL Dense Buffer(配方：0.1mol·L

1.3蛋白浓度测定

参照索莱宝生物公司BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行蛋白浓度测定：配制BSA标准品体系，(分别配成0、0.4、0.8、1.2、1.6、2mg/mL)。酶标板每孔加标准品或稀释10倍后的蛋白样品各20μL，和显色反应液100μL，37℃孵育30min后单波长吸光值562nm下读取对应OD值。根据制作的标准曲线，计算样品浓度；

1.4 Western blot

取10μg蛋白样品，加入适量的蛋白上样缓冲液，99℃水浴变性7～10min；用10％SDS-PAGE凝胶电泳分离总蛋白；电泳结束后15V的恒定电压下半干法转移30min至PVDF膜(Bio-Rad，1703959)上；利用溶于1×TBST(Solarbio，T1081，北京)的5％脱脂奶粉封闭缓冲液封闭转膜后的PVDF膜，摇床摇动1h，1×TBST清洗膜三次，每次10min；将封闭的PVDF膜与GSS1和GSS2共用一抗(ABclonal)(1：2000)室温孵育2h，1×TBST洗脱三次，每次10min；加入与辣根过氧化物酶标记HRP的山羊抗兔IgG二抗孵育1h(1：10000，Affinity，S0001)，1×TBST洗脱三次，每次10min；用特超敏ECL化学发光底物(碧云天，P0018AS)进行显色，显色后用AMERSHAM IMAGER 600超灵敏多功能成像仪拍照编辑并保存结果。单克隆抗体α-Tubulin的一抗用作内参抗体(1：5000，Sigma，T6074)。

1.5基于WB灰度值的蛋白定量

为定量GSS1或GSS2的蛋白含量，将图片利用ImageJ(1.51版)进行定量。其流程参考软件说明书。

2、基于免疫荧光技术检测昆虫内源GSS1和GSS2蛋白表达特性

2.1将4龄小菜蛾幼虫进行石蜡包埋，将切片脱蜡至水：依次将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-二甲苯III 15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。

2.2抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(pH＝6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(pH＝7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2.3阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS(pH＝7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2.4血清封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，在组化圈内滴加3％BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。(一抗是山羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用BSA封闭)

2.5加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的GSS1和GSS2共用一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

2.6加二抗：切片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50min。

2.7DAB显色：切片置于PBS(pH＝7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

2.8复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水漂洗，苏木素分化液分化数秒，自来水漂洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。

2.9脱水封片：将切片依次放入75％酒精5min-85％酒精5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

3、基于小菜蛾不同突变体检测GSS1存在于口腔分泌蛋白

3.1材料收集

将人工饲料品系幼虫预先进行4h的饥饿处理。转移虫体于拟南芥叶片的离体叶片。将叶片的一半人为制造伤口后利用锡箔纸覆盖防止虫体取食作为未取食的对照组(CK)，另一半放置饥饿处理的幼虫进行取食。

3.2成像

取食6h后，移除幼虫，先于明场拍摄照片，随即将拟南芥叶片进行半干转膜，膜的处理、转膜条件和显色流程同步骤1.4。将显色后的照片与明场照片进行图层叠加获得GSS1或GSS2的蛋白原位杂交结果。

3.3小菜蛾不同突变体的获得

采用CRISPR/Cas9常规技术获得。其流程参考本人发表的论文：Functions ofduplicated glucosinolate sulfatases in the development and host adaptation ofPlutella xylostella,doi.org/10.1016/j.ibmb.2020.103316.

3.4基于WB技术检测不同突变体取食后的拟南芥总蛋白

将人工饲料品系幼虫(WT)，GSS1

4、基于WB技术检测GSS1不受底物诱导表达

4.1样本收集

将人工饲料切至2×1.5×0.2cm大小，用移液枪吸取200μL拟南芥总硫苷提取液和单一硫苷Sinigrin(Sigma-Aldrich，85440)分别均匀涂抹至人工饲料表面，放置饥饿4h后的三龄幼虫于饲料上取食12h和24h，收集两个时间点样品；将上述收集样品液氮迅速冷却置于-80℃冰箱保存。

4.2蛋白提取、浓度、WB和表达量分析的同步骤1.2-1.5。

5、基于GSS1为口腔分泌物的内参蛋白定量GOX蛋白含量

5.1样本收集

将无菌培养皿置于冰上，且中央加入10μL含有1mM蛋白酶抑制剂PMSF的1×PBS，通过指肚挤压4龄小菜蛾幼虫腹部(约100只，剔除因挤压损伤的昆虫样本)，将每只幼虫可见的口腔分泌物转移至PBS中，将收集好的样品在PVDF膜上点样2μL，室温晾干5min后进行点杂交实验。

5.2 WB实验

点样后的PVDF的封闭、GSS1和GSS2共用多克隆抗体孵育、膜的清洗及其膜显色流程同步骤1.4。

5.3葡萄糖氧化酶(GOX)的含量鉴定

已知小菜蛾口腔分泌中包含葡萄糖氧化酶(GOX)，因此将GOX多克隆抗体(实验室自备)同样孵育昆虫口腔样本，其样本收集的流程和点杂交的操作同步骤5.1和5.2；膜的显影同步骤1.4；基于WB灰度值的蛋白定量同步骤1.5，将GOX的灰度值比去GSS1的灰度值，获得GOX的蛋白含量(图6B)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围的内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。