抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白近等基因系小菜蛾中肠蛋白质基因组学研究

摘要

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂，其编码Bt杀虫毒蛋白基因作为主要的杀虫基因转入到多种作物中，在害虫防治中成效显著。但与此同时，Bt制剂的大量使用和转Bt作物的广泛种植，使得Bt的抗性问题越来越严重。十字花科重要害虫小菜蛾Plutellaxylostella(L.)是最早被发现且目前仅有的6种在田间对Bt产生抗性的害虫之一。但到目前为止，Bt对小菜蛾的杀虫作用过程和小菜蛾对Bt的抗性机理，研究的仍不是完全清楚。
　　在本研究中，我们建立了对Cry1Ac有高于5000倍抗性的近等基因系小菜蛾种群，同时研究了其相关生物学特性。同时，我们首次利用shotgunHPLC-ESI-MS/MS技术对小菜蛾幼虫中肠蛋白质进行了蛋白质基因组分析。同时为了更好的揭示小菜蛾抗Cry1Ac的分子机理，我们利用iTRAQ和MRM两种蛋白质组分析技术，对两个种群的中肠蛋白质组进行了定量分析，发现了大量差异表达蛋白质和可能的Bt受体。结果如下:
　　1.小菜蛾抗Cry1Ac近等基因系种群的构建
　　我们利用弗罗里达Florida抗Cry1Ac小菜蛾DBM1Ac-R与纽约日内瓦Geneva敏感种群DBM1Ac-S，建立了两套近等基因系种群。经ISSR分子标记技术对其近等性进行评估发现，利用高世代回交法构建的近等基因系抗性种群BC7F3(更名为NIL-R)，与轮回亲本敏感种群DBM1Ac-S之间的遗传相似度达到98.24％，具有较高的相似度，且其对Cry1Ac毒蛋白的抗性倍数保持在5000倍以上，是理想的实验材料。
　　2.抗Cry1Ac近等基因系小菜蛾的抗性相关生物学研究
　　我们利用以上建立的抗Cry1Ac小菜蛾近等基因系种群NIL-R开展相关生物学研究。我们通过3次生命表对NIL-R种群的抗性适合度研究发现:在卵的大小、寿命、幼虫发育、成虫寿命和产卵量上，抗性种群NIL-R与敏感种群DBM1Ac-S相比没有显著差别，说明NIL-R没有出现发育的延迟;利用两种群的内禀增长率(R0)计算相对适合度，三次生命表结果分别为1.016、0.940和0.932，说明抗Cry1Ac小菜蛾近等基因系种群NIL-R没有抗性适合度代价。根据交互抗性谱分析发现:NIL-R对Cry1Ab毒蛋白和Cry1Ah蛋白具有一定的交互抗性，对Cry1Ca毒蛋白和Cry1Ie毒蛋白没有交互抗性，由此我们可以推断小菜蛾对Cry1A类毒蛋白可能具有共同的受体位点，而与Cry1Ca毒蛋白和Cry1Ie毒蛋白的受体位点不同。利用单对杂交实验和剂量对数-期望死亡机率曲线两种方法研究其遗传方式发现:抗性近等基因系种群NIL-R对Cry1Ac的抗性由一个常染色体、不完全隐形的基因位点决定。
　　3.利用shotgunESI-MS对小菜蛾幼虫中肠进行蛋白质基因组研究
　　我们利用shotgunHPLC-ESI-MS/MS对小菜蛾幼虫中肠蛋白质进行测定，结合其基因组数据，完成了首个小菜蛾中肠蛋白质基因组分析。通过研究，一共得到了876，341张质谱图，将这些质谱图与小菜蛾基因组的蛋白质数据库及全基因组6框翻译的蛋白数据相比对，共鉴定出15，887条肽段。其中，12，004条肽段与已经发表的小菜蛾基因组中的预测蛋白质信息相匹配，同时发现了2113新肽段。利用这些发现的新肽段鉴定得到491个新基因，修正了202个小菜蛾基因组注释基因。通过对小菜蛾中肠蛋白质组的功能注释分析我们发现脂质消化作用相关酶和基因在小菜蛾中肠蛋白质中占据了重要地位，这可能是小菜蛾与其主要寄主十字花科作物的共进化的又一证据。同时我们从这些蛋白质数据鉴定到了大量与小菜蛾杀虫剂抗性相关的蛋白质，为小菜蛾适应性及广泛抗药性等的分子机理、功能基因组研究供了必要的数据支持。
　　4.抗Cry1Ac近等基因系小菜蛾的比较蛋白质组研究
　　我们利用iTRAQ技术，对NIL-R和DBM1Ac-S两个种群的中肠BBMV进行蛋白质定量比较研究，共筛选出了128个差异表达蛋白质。其中发现了氨肽酶和ABC转运蛋白质两个已报道的Bt受体蛋白质，在抗性种群中的表达量显著低于敏感种群。这可能说明这两个蛋白质也是Cry1Ac在小菜蛾中的受体。我们还发现了一个葡糖基转移酶的显著升高。另外，我们还发现了细胞色素P450解毒酶和谷胱甘肽转移酶两个解毒酶在抗性种群中显著升高的现象。随后，我们利用MRM技术对找出的差异蛋白质及已报道的Bt受体进行质谱定量检测，比较以上蛋白质在两个种群的中肠样品的表达量差异情况。MRM技术检测的结果与iTRAQ结果基本一致。另外，我们还发现氨肽酶、ABC转运蛋白质、碱性磷酸酶、钙黏蛋白以及鞘糖脂等潜在受体蛋白质在抗性小菜蛾中都有显著的降低。这个结果说明在本研究的小菜蛾种群抗Cry1Ac过程中，这些潜在受体蛋白质可能都不同程度的发挥着作用。

目录

声明

摘要

第1章 前言

1．1 苏云金芽孢杆菌及小菜蛾概述

1．1．1 苏云金芽孢杆菌

1．1．2 Bt晶体毒蛋白的杀虫机理及抗性

1．1．3 小菜蛾及其危害

1．1．4 小菜蛾对苏云金芽孢杆菌的抗性

1．2 抗Bt小菜蛾的生物学研究进展

1．2．1 小菜蛾对Bt的交互抗性

1．2．2 抗性遗传方式

1．2．3 抗性适合度代价

1．3 昆虫抗性近等基因系的研究

1．3．1 近等基因系的研究

1．3．2 昆虫抗性近等基因系

1．4 蛋白质组学

1．4．1 蛋白质基因组简介

1．4．2 蛋白质组在昆虫中肠研究中的应用

1．4．2 蛋白质组(iTRAQ)技术

1．4．3 目标蛋白的质谱定量检测技术(MRM)

1．5 本研究目的意义和基本内容

1．5．1 本研究的目的意义

1．5．2 本研究技术路线

第2章 小菜蛾抗Cry1Ac近等基因系的建立与维持

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 实验方法

2．2 试验结果

2．3．1 高世代回交法构建近等基因系种群

2．3．2 重组自交系法构建近等基因系种群

2．3．3 利用ISSR评估种群近等性

2．3 小结与讨论

第3章 抗Cry1Ac近等基因系小菜蛾的抗性相关生物学研究

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 实验方法

3．2 实验结果

3．2．1 近等基因系抗性小菜蛾与其他Cry蛋白的交互抗性

3．2．2 抗Cry1Ac近等基因系小菜蛾的生命表

3．2．3 抗Cry1Ac近等基因系小菜蛾的适合度

3．2．4 利用单对杂交研究抗性遗传方式

3．2．5 利用死亡几率曲线研究抗性遗传方式

3．3 小结与讨论

第4章 小菜蛾幼虫中肠的蛋白质基因组学研究

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果与讨论

4．2．1 数据库情况

4．2．1 鉴定肽段情况

4．2．2 与基因组注释编码蛋白的基因相匹配的基因

4．2．3 与核酸序列匹配的肽段序列(GSSP)

4．2．4 利用GSSPs修正现有的基因模型

4．2．5 可变剪接数据库的构建及研究

4．2．6 新基因的确定

4．2．7 小菜蛾幼虫中肠蛋白质的理化性质

4．2．8 小菜蛾幼虫中肠中高丰度蛋白质

4．2．9 GO分析

4．2．10 KEGG分析

4．2．11 假定蛋白的鉴定

4．2．12 与杀虫剂抗性相关的蛋白质

4．3 小结与讨论

第5章 抗Cry1Ac近等基因系小菜蛾的比较蛋白质组研究

5．1 材料与方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 实验方法

5．2 实验结果

5．2．1 幼虫中肠BBMV

5．2．2 蛋白质和肽段的鉴定

5．2．3 差异表达蛋白质

5．2．4 差异表达蛋白质GO富集分析

5．2．5 MRM实验方法的建立

5．2．6 MRM测定结果的质控

5．2．7 差异表达蛋白及Bt受体的MRM验证

5．3 小结与讨论

第6章 结论与展望

参考文献

附录 攻读博士学位期间论文发表情况

致谢