稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株的构建方法及其应用

摘要

本发明公开了稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株的构建方法，包括如下步骤：1)慢病毒转染；2)超速离心；3)细胞感染和第一次流式荧光分选；4)第二次流式荧光分选。本发明属于基因工程技术领域，本发明通过将慢病毒转染法、超速离心法和流式荧光分选法相结合，提供一种稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株的构建方法及其应用，克服了CRISPR/dCas9系统难转染、不能长时间稳定表达的缺陷，实现了CRISPR/dCas9系统的稳定表达，可实现对DNA甲基化的靶向调控。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株的构建方法及其应用。

背景技术

DNA甲基化是研究最早的表观遗传调控模式，指的是在DNA甲基化修饰酶(甲基转移酶和去甲基转移酶)的作用下在胞嘧啶第5位碳原子上添加或去除一个甲基基团。DNA甲基化广泛参与基因转录调控、细胞分化、胚胎发育、X染色体失活、基因印记、肿瘤发生发展等细胞过程。然而，由于技术水平的限制，现有的DNA甲基化调控主要是通过改变DNA甲基化修饰酶的活性，在全基因组水平调控DNA甲基化的变化，而无法满足对特定基因的DNA甲基化进行靶向调控的需求。甲基化修饰是高度精细化和持续化的过程，因此，亟需一种特异性DNA甲基化编辑技术，在不影响其他基因的情况下，研究单个基因甚至特定CpG位点DNA甲基化的功能和作用机制，为深入研究DNA甲基化修饰的功能及相关药物研发提供有效的工具。

细菌和古细菌进化出的CRISPR(聚簇有规律间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关蛋白)系统是由小RNA介导的自适应免疫系统，能识别和破坏进入宿主的外源DNA(病毒和质粒)或使其沉默，经工程化改造后，可用于基因编辑和表观遗传学调控。研究人员在此基础上对链球菌中Cas9的核酸酶结构域进行了突变，从而产生核酸内切酶活性缺失的Cas9，称为dead Cas9(dCas9)。dCas9不再能够切割DNA，但它仍然可以在sgRNA的引导下以同样的精度靶向和结合DNA。通过设计与靶标DNA互补的特异性sgRNA，并将dCas9和DNA甲基修饰酶融合，CRISPR/dCas技术有望实现特异性DNA甲基化调控。专利申请CN 111073902A公开了提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体及其构建方法和应用，建立了适用于埃德菌的CRISPR/dCas9特异性转录调控体系，促进埃德菌FS110胶霉毒素生物合成的转录调控。

慢病毒载体由HIV病毒改造而来，可将目的基因介导入靶细胞，进行长时间的稳定表达。相较于部分腺病毒载体，慢病毒转染能大大提高目的基因的介导效率。然而，对于一些分子量较大的质粒，使用慢病毒载体转染也会存在转染效率低的问题。CRISPR/dCas9系统可用于甲基化修饰，但存在质粒大，转染效率低或难以稳定转染的局限性。因此，提供稳定表达CRISPR/dCas9-TET1CD系统、且能长期稳定体外培养的单克隆细胞株具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题(转染效率低或难以稳定转染的缺陷)，本发明通过将慢病毒转染法、超速离心法和流式荧光分选法相结合，率先提供一种稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株的构建方法及其应用，克服了CRISPR/dCas9系统难转染、不能长时间稳定表达的缺陷，实现了CRISPR/dCas9系统的稳定表达，可实现对DNA甲基化的靶向调控。

本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。

本发明提供稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株的构建方法，包括如下步骤：

1)慢病毒转染：接种并培养293FT细胞，待细胞融合度达到70％-90％，使用转染试剂，将核心质粒与慢病毒包装质粒系统进行转染，在第48h和96h收集病毒液；

2)超速离心：将收集的病毒液用滤膜过滤，混匀并超速离心2-2.5h，离心条件为4℃、22000-26000rpm；离心后去上清，加PBS溶液重悬，得到病毒蛋白重悬液，4℃保存；

3)细胞感染和第一次流式荧光分选：在6孔板中接种并培养靶细胞A549，培养20-28h后，滴加所述病毒蛋白重悬液感染两次，将靶细胞传代扩增培养2-4代后，进行第一次流式荧光分选，使用流式管回收细胞，获得表达CRISPR/dCas9系统的细胞株；

4)第二次流式荧光分选：将所述表达CRISPR/dCas9系统的细胞株进行第二次流式荧光分选，细胞回收方式为96孔板回收，每孔回收1个细胞；第二次流式荧光分选后4-8h用显微镜观察细胞贴壁情况并初步筛选出单克隆细胞，待细胞长满96孔板时，再用胰蛋白酶消化细胞并转移，传代扩增2-3代后，再进行流式荧光分析验证，得到稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株。

本发明以CRISPR/dCas9-TET1CD为核心质粒，采用特定质量比的psPAX2和pMD2.G作为慢病毒包装质粒系统进行转染，在第48h和96h收集病毒液，并在特定条件下进行超速离心，获得浓缩的病毒颗粒，提高转染效率；由于转染质粒的分子量较大，转染效率相对较低，将靶细胞传代扩增培养2-4代后，使用足够多的细胞(细胞数大于250万个)去分选，这样保证在较低阳性率的情况下获得足够的阳性细胞，利于阳性细胞的增殖培养。同时，利用目的基因自带的荧光标记，通过第一次流式荧光分选将少量的阳性细胞分选出来，使用流式管回收细胞，克服了低转染效率下药物筛选得不到阳性细胞株的缺陷。由于使用流式管回收，第一次流式荧光分选得到的带荧光细胞并不是百分之百的阳性细胞，即可能将非阳性细胞误认为阳性细胞，因此在传代过程中由于非阳性细胞的细胞生长优势，阳性细胞比例将逐渐下降。在此发现的基础上，本发明进而开展第二次流式荧光分选，并采用不同的细胞回收方式，克服了第一次流式分选得到的非阳性细胞在传代过程中由于细胞生长优势导致阳性细胞比例逐渐下降的缺陷，选择阳性细胞单独培养，传代培养后经流式荧光分析验证(只分析阳性率，不回收细胞)，最终获得稳定表达的单克隆细胞株。

优选地，所述转染试剂为Polyethylenimine(PEI)MAX；所述核心质粒为CRISPR/dCas9-TET1CD，所述慢病毒包装质粒系统包括psPAX2和pMD2.G，CRISPR/dCas9-TET1CD、psPAX2和pMD2.G的质量比为6:6:5，转染质粒与转染试剂的用量比为1μg:3μL。转染质粒包括核心质粒和慢病毒包装质粒系统。

优选地，所述病毒蛋白重悬液的病毒滴度为1×10

优选地，所述滤膜为Millipore滤膜，孔径为0.45μm。

优选地，所述第一次流式荧光分选和第二次流式荧光分选的通道分别为tagBFP，激发波长为400nm，发射波长为450nm。

相应地，本发明还提供一种稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株，采用所述的构建方法构建得到。

此外，本发明还提供一种稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株在制备治疗DNA甲基化相关疾病的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明通过将慢病毒转染法、超速离心法和流式荧光分选法相结合，优化慢病毒包装质粒系统组成及其质量比、病毒液收集、超速离心和病毒滴度等操作条件，提供一种稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株的构建方法及其应用，克服了CRISPR/dCas9系统难转染、不能长时间稳定表达的缺陷，实现了CRISPR/dCas9系统的稳定表达，可实现对DNA甲基化的靶向调控。本发明提供了稳定表达CRISPR/dCas9-TET1CD单克隆细胞株，可利用单克隆细胞株对特定基因或位点进行DNA甲基化修饰改变，为研究特定基因或位点DNA甲基化功能及作用机制提供了有利工具，有望在制备治疗DNA甲基化相关疾病的药物中发挥重要应用。

附图说明

图1本发明提供的构建方法流程示意图。

图2本发明中所使用的CRISPR/dCas9-TET1CD质粒谱图。

图3本发明实施例的第一次流式荧光分选的细胞检测结果图。

图4本发明实施例的第一次流式荧光分选的细胞经传代扩增培养7代后的检测结果图。

图5本发明实施例得到的单克隆细胞株的验证结果图。

图6本发明对比例2的流式荧光分选的细胞检测结果图。

图7本发明对比例3的流式荧光分选的细胞检测结果图。

图8本发明实施例得到的单克隆细胞株dCas9、TET1CD的mRNA表达量检测结果图。

图9本发明实施例提供的单克隆细胞株Line 1DNA甲基化检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明中，所涉及的材料和试剂均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得，如CRISPR/dCas9-TET1CD购自Addgene公司，psPAX2购自Addgene公司，pMD2.G购自Addgene公司，Polyethylenimine MAX购自Polysciences公司。

293FT和A549细胞的培养条件：DMEM培养基(含10％体积百分含量的胎牛血清)、5％CO

实施例一 稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株的构建

稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株的构建方法流程示意图如图1所示，具体包括如下步骤：

1)慢病毒转染：在10个10cm细胞培养皿中接种293FT细胞，细胞接种数为5×10

2)超速离心：将收集的病毒液用0.45μm孔径的Millipore滤膜过滤，混匀，平均分配到6个离心管，超速离心2h，离心条件为4℃、25000rpm；离心后去上清，每个离心管加200μL1×PBS重悬病毒蛋白，得到病毒蛋白重悬液，病毒蛋白重悬液的病毒滴度为1.05×10

3)细胞感染和第一次流式荧光分选：在6孔板中接种并培养靶细胞A549，细胞接种数为2×10

4)第二次流式荧光分选：将所述表达CRISPR/dCas9系统的细胞株进行第二次流式荧光分选，细胞回收方式为96孔板回收，每孔回收1个细胞；第二次流式荧光分选后6h，用显微镜观察细胞贴壁情况并初步筛选出单克隆细胞，待细胞长满96孔板时，再用胰蛋白酶消化细胞并转移，传代扩增2代后，再进行流式荧光分析验证，得到稳定转染CRISPR/dCas9系统的单克隆细胞株。验证结果图如图5所示，此步骤克服了流式分选技术难以100％分选出阳性细胞的缺陷，将阳性细胞单个分选，进而选择阳性细胞单独培养，最终获得稳定表达的单克隆细胞株。

对比例1

发明人使用现有的磷酸钙共沉淀法，按CRISPR/dCas9-TET1CD核心质粒:VSVG:△8.9＝8:1:6的质量比转染293FT细胞，每皿293细胞所产病毒感染靶细胞A549，转染后48h和72h收集两次病毒液，感染两次，筛选方法为嘌呤筛选，由于质粒较大，转染效率低，不能获得稳定转染CRISPR/dCas9系统的靶细胞。

对比例2

发明人在2个10cm细胞培养皿中接种293FT细胞，使用Polyethylenimine(PEI)-MAX转染试剂，PEI应用液浓度为1mg/ml，将CRISPR/dCas9-TET1CD核心质粒与慢病毒包装质粒系统(包括psPAX2和pMD2.G)进行转染，CRISPR/dCas9-TET1CD、psPAX2和pMD2.G的质量比为4:3:1，转染质粒与转染试剂的用量比为1μg:3μL，第48h和96h收集病毒液；将收集的病毒液直接滤至Amicon Ultra-15ml超滤管中，于Allegra X-15R台式冷冻离心机中4000×g，4℃离心30min浓缩病毒液；向浓缩后的病毒液中加入100μl含10％体积百分含量FBS的完全培养基制成病毒蛋白悬液，4℃保存。每次感染滴加100μL所述病毒蛋白重悬液，感染两次。

对比例2与实施例一的区别主要在于：CRISPR/dCas9-TET1CD、psPAX2和pMD2.G的质量比不同，使用超滤管浓缩，未超速离心。对比例2通过第一次流式荧光分选，获得表达CRISPR/dCas9系统的细胞株，细胞检测结果图如图6所示，分选阳性率仅0.071％。

对比例3

发明人在5个10cm细胞培养皿中接种293FT细胞，使用Polyethylenimine(PEI)-MAX转染试剂，PEI应用液浓度为1mg/ml，将CRISPR/dCas9-TET1CD核心质粒与慢病毒包装质粒系统(包括psPAX2和pMD2.G)进行转染，CRISPR/dCas9-TET1CD、psPAX2和pMD2.G的质量比为6:6:5，转染质粒与转染试剂的用量比为1μg:3μL，将转染的293FT细胞扩大培养至5培养皿，第48h和96h收集病毒液；将收集的病毒液用0.45μm孔径的Millipore滤膜过滤，混匀，平均分配到4个离心管，超速离心1.5h，离心条件为4℃、25000rpm；离心后去上清，每个离心管加200μL 1×PBS重悬病毒蛋白，得到病毒蛋白重悬液，4℃保存。每次感染滴加100μL所述病毒蛋白重悬液，感染两次。

对比例3与实施例一的区别主要在于：病毒量更少，离心时间更短，导致病毒蛋白重悬液的病毒滴度更低。对比例3通过第一次流式荧光分选，获得表达CRISPR/dCas9系统的细胞株，细胞检测结果图如图7所示，分选阳性率仅0.337％。

对比例4

发明人在10个10cm细胞培养皿中接种293FT细胞，使用Polyethylenimine(PEI)-MAX转染试剂，PEI应用液浓度为1mg/ml，将CRISPR/dCas9-TET1CD核心质粒与慢病毒包装质粒系统(包括psPAX2和pMD2.G)进行转染，CRISPR/dCas9-TET1CD、psPAX2和pMD2.G的质量比为6:6:5，转染质粒与转染试剂的用量比为1μg:3μL，第48h和96h收集病毒液；将收集的病毒液用0.45μm孔径的Millipore滤膜过滤，混匀，平均分配到6个离心管，超速离心2h，离心条件为4℃、25000rpm；离心后去上清，每个离心管加200μL 1×PBS重悬病毒蛋白，得到病毒蛋白重悬液，4℃保存。每次感染滴加200μL所述病毒蛋白重悬液，感染两次。

对比例4与实施例一的区别主要在于：每次感染的病毒蛋白重悬液滴加量为200μL。结果：病毒滴度过高，导致靶细胞死亡，并未分选获得阳性细胞。

实施例二 稳定表达CRISPR/dCas9系统的A549单克隆细胞株mRNA表达量检测

采用TRIzol法提取实施例一获得的稳定表达CRISPR/dCas9系统的A549单克隆细胞株总RNA，使用TAKARA公司逆转录试剂盒进行逆转录，生成cDNA，按照TOYOBO公司

表1本发明所用引物

结果如图8所示，成功构建稳定表达CRISPR/dCas9系统的A549单克隆细胞株，其dCas9和TET1CD的mRNA表达量明显高于对照组。

实施例三 稳定表达CRISPR/dCas9系统的A549单克隆细胞株Line1 DNA甲基化检测

提取实施例一获得的稳定表达CRISPR/dCas9系统的A549单克隆细胞株基因组DNA检测情况，以考察对全基因组DNA甲基化的影响，具体包括如下步骤：

①将所构建的细胞株进行消化，利用TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取细胞基因组DNA；

②亚硫酸氢盐修饰：

使用QIAGEN EpiTect Bisulfite Kit(货号：59104))对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰；

③焦磷酸测序：

使用QIAGEN PyroMarkPCRKit(货号：978703)对亚硫酸氢盐修饰后的DNA进行焦磷酸测序，测序所需引物如表1所示。

结果如图9所示，稳定表达CRISPR/dCas9-TET1CD单克隆细胞株并不会改变非靶向基因的DNA甲基化水平。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中山大学

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<212> DNA

<213> 人工序列（RenGongXuLie)

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