一种基于上转换荧光循环扩增同时检测黄曲霉毒素和赭曲霉毒素的方法

摘要

本发明属于真菌毒素检测领域，具体涉及一种基于上转换荧光循环扩增同时检测赭曲霉毒素和黄曲霉毒素B1的方法；步骤为：首先制备上转换纳米材料，然后进行上转换纳米材料的修饰，同时制备特定发射波长的AuNRs溶液，最后构建OTA和AFB1特异性检测体系，根据荧光光谱信息和浓度建立预测模型；通过检测样品待测液的荧光光谱信息，即可实现样品中AFB1和OTA的同时检测；本发明能够对两种目标物同时检测，操作简便，并具有高灵敏度和高选择性。

说明书

技术领域

本发明属于真菌毒素检测领域，特别是涉及一种基于上转换荧光循环扩增同时检测赭曲霉毒素(OTA)和黄曲霉毒素B1(AFB1)的方法。

背景技术

真菌毒素是真菌在生长过程中自然产生的次级代谢产物，世界范围内大约有25％的粮食作物受到不同程度的侵染。主要通过污染人们所吃的食物而进入食物链，从而对人类的生命健康造成严重影响。真菌毒素常常侵害肝脏、肾脏、大脑神经系统等器官，产生肝硬化、肝癌、急慢性肾炎、大脑中枢神经系统出血症状。黄曲霉毒素是所有真菌毒素中毒性最强、危害最大的一类，因此被国际癌症研究机构认定为一类致癌物。赭曲霉毒素在自然界中分布最广泛，与人类生活密切相关，常存在于各种食品、饲料及其他农副产品中，对人类健康造成巨大威胁。因此，加大对粮食作物中真菌毒素的监察力度，建立科学可行的真菌毒素检测方法至关重要。

目前，真菌毒素检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相质谱联用法及基于免疫识别建立的免疫法等。薄层层析法操作步骤较繁琐，灵敏度及特异性低，已不能满足现代检测的需要。而常用的色谱分析法，样品前处理方法复杂、繁琐，且需要熟练掌握仪器操作技术，不便基层推广。免疫检测法虽具有灵敏度高、特异性强等优点，但是只能单一检测、重复性差、成本昂贵。因此，开发一种快速方便、灵敏度高、特异性强、成本低廉、可同时检测的方法很有必要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有检测技术的不足，提供一种基于上转换纳米材料和Rnase-H同时检测OTA和AFB1的方法，可消除其他类似物的干扰，实现低成本、高灵敏的快速、同时检测。

为实现以上目的，本发明采取的技术方案如下：

步骤一，上转换纳米材料的制备：

(a)将氧化钇、氧化镱、氧化铒分别溶于三氟乙酸中，再加入氟化钠，得到的混合液A，将混合溶液A转移至含有油胺和1-十八烯的容液中；持续充入氮气并进行磁力搅拌，加热反应后冷却至室温；然后加入环己烷和乙醇的混合液进行离心洗涤；离心所得沉淀再用纯净水离心清洗，最后经冷冻干燥得到上转换纳米材料，记为UCNPs1；

(b)与步骤(a)方法和参数条件相同，区别为将步骤(a)中的氧化钇、氧化镱、氧化铒替换为将氧化钇、氧化镱、氧化铥；最终得到上转换纳米材料，记为UCNPs2；

步骤二，上转换纳米材料的修饰：

(a)将步骤一所得UCNPs1溶解于异丙醇A中，然后依次加入蒸馏水和氨水，封口快速搅拌，随后滴加入异丙醇B和正硅酸四乙酯的混合液，持续搅拌一段时间，再滴加入异丙醇C和3-氨丙基三乙氧基硅烷；滴加后停止搅拌，在室温下静置陈化，陈化后进行离心分离，再经冷冻干燥得到表面带有氨基修饰的上转换纳米颗粒，记为NH

(b)步骤(b)与步骤(a)的操作和参数条件均相同，区别是将UCNPs1替换为UCNPs2；最终得到表面带有氨基修饰的上转换纳米颗粒，记为NH

步骤三，特定发射波长AuNRs的制备：

(a)种子液的制备：氯金酸溶液(HAuCl

(b)AuNRs溶液的制备：将CTAB和油酸钠溶于去离子水A中，随后加入硝酸银，静置反应后得到混合液A；向混合液A中加入HAuCl

步骤四，特异性检测体系的构建：

(a)将步骤二所得NH

(b)与步骤(a)的操作和参数条件均相同，区别是将NH

(c)将步骤三中制备的AuNRs溶液分别加入到NH4-UCNPs1-RNA1和NH4-UCNPs1-RNA2中，得到混合溶液A和混合溶液B，均置于摇床内进行孵育，孵育后使用PBS缓冲液清洗，清洗后经离心，得到的产物分别记为产物A和产物B；再将产物A和产物B分别分散于PBS缓冲溶液中得到两种荧光检测探针溶液，分别记为Probe-RNA1和Probe-RNA2；

(d)选择两种碱基互补配对的DNA1-cDNA1和DNA2-cDNA2与一定浓度的OTA溶液和AFB1溶液混合；随后加入步骤(c)所得Probe-RNA1和Probe-RNA2；最后加入Rnase-H进行共同孵育，孵育后得到待测溶液，即构建OTA和AFB1特异性检测体系；

步骤五，OTA和AFB1的检测：

取步骤四中制备的待测溶液，梯度设置其中OTA和AFB1的浓度，并对已知OTA和AFB1浓度的待测溶液进行荧光光谱信息的采集，根据荧光光谱信息和浓度建立预测模型；

步骤六，样品中OTA和AFB1的检测：

参照GB 5009.96-2016和GB 5009.22-2016的方法，对样品进行处理，制备样品提取液；然后，向Probe-RNA1和Probe-RNA2中加入样品提取液，再加入Rnase-H共同孵育，孵育后得到样品待测溶液，采集样品待测溶液的荧光光谱；随后将所采集荧光光谱信息导入步骤五所建立预测模型；经过模型计算得到样品中OTA和AFB1的具体浓度值，实现样品中OTA和AFB1的同时检测。

优选的，步骤一的(a)中，所述氧化钇、氧化镱、氧化铒与三氟乙酸的用量关系为74-80mol:18-24mol:1.8-2.2mol:5mL；所述氟化钠在混合溶液A中的浓度为10mmol/L；

所述混合溶液A中的三氟乙酸与油胺、1-十八烯的用量比为5mL:20mL:20mL；所述环己烷和乙醇的混合液与混合溶液A中三氟乙酸的用量比为100-200mL:5mL；所述环己烷和乙醇的体积比为2:1。

优选的，步骤一的(a)中，所述加热反应的温度为320℃，反应时间为1h。

优选的，步骤二的(a)中，所述UCNPs1、异丙醇A、蒸馏水、氨水的用量比为20mg:50-65mL:15-25mL：2-3mL；所述氨水与异丙醇B、正硅酸四乙酯、异丙醇C、3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为2-3mL:17-22mL:50-70μL:25-33mL:180-200μL；所述续搅拌一段时间为3h；所述室温下静置陈化的时间为2h。其中异丙醇A、异丙醇B、异丙醇C均为异丙醇，不同字母仅作名称上的区分。

优选的，步骤三的(a)中，所述氯金酸溶液、十六烷基三甲基溴化铵溶液和硼氢化钠溶液的用量比为5mL:5mL:0.6mL；所述氯金酸溶液的浓度为0.5mmol/L，所述十六烷基三甲基溴化铵溶液的浓度为0.2mol/L，所述硼氢化钠溶液的浓度为10mmol/L。

优选的，步骤三的(a)中，所述搅拌一段时间为2～5min；所述一定温度条件下静置的温度为30℃，时间为30min。

优选的，步骤三的(b)中，所述CTAB、油酸钠、去离子水A和硝酸银用量比为1.8g:0.2468g:50mL:4.8mL；所述硝酸银的浓度为4mmol/L；所述加入硝酸银静置反应条件为：温度30℃，反应时间15min；

优选的，步骤三的(b)中，所述混合液A中的去离子水A与HAuCl

优选的，步骤三的(b)中，所述混合液B中抗坏血酸溶液、种子液、去离子水B的用量比为0.15-0.20mL:0.025-0.05mL:50mL；所述搅拌温度为30℃，时间为30s，静置时间为12h。其中去离子水A、去离子水B均为去离子水，不同字母仅作名称上的区分。

优选的，步骤四的(a)中，所述NH

优选的，步骤四的(a)中，所述置于摇床进行反应的温度为26℃，反应时间为2h，所述震荡孵育时间为12h；所述加入PBS缓冲溶液C与RNA1的用量为比5mL:0.8-1.2mL，所述RNA1的浓度为40-60nmol/L，孵育过夜的温度为37℃。

优选的，步骤四的(a)和(b)中，所述NH4-UCNPs1-RNA1和NH4-UCNPs1-RNA2的浓度均为1.8-2.1mg/mL。

优选的，步骤四的(c)中，所述AuNRs溶液与NH4-UCNPs1-RNA1的用量关系为1mL:5.8-6.2mL；所述AuNRs溶液与NH4-UCNPs1-RNA2的用量关系为1mL:5.8-6.2mL，所述孵育的温度为37℃，时间为12h；所述PBS缓冲液的用量为50mL；所述Probe-RNA1和Probe-RNA2的浓度均为1.6-2mg/mL。

优选的，步骤四的(d)中，所述DNA1-cDNA1、DNA2-cDNA2、OTA溶液和AFB1溶液的用量关系为1.5mL:1.5mL:0.5mL:0.5mL，所述DNA1-cDNA1和DNA2-cDNA2的浓度均为0.5μmol/L，OTA如有和AFB1溶液的浓度均为0.1-100μg/L；

优选的，步骤四的(d)中，所述加入OTA溶液、Probe-RNA1、Probe-RNA2和Rnase-H溶液用量比为0.5mL:0.5mL:0.5mL:0.2μL；所述Rnase-H溶液的浓度为60U/μL；所述共同孵育的时间为10-70min。

优选的，步骤(五)中所述梯度设置OTA和AFB1的浓度范围为0.1-100μg/L；所述建立预测模型为SiPLS模型。

优选的，步骤(六)中所述样品提取液、Probe-RNA1、Probe-RNA2、Rnase-H用量比为0.5mL:0.5mL:0.5mL:0.2μL；所述Rnase-H溶液的浓度为60U/μL；所述Probe-RNA1和Probe-RNA2的浓度均为1.6-2mg/mL所述共同孵育时间为10-70min。

本发明涉及的试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其适配体序列如表1所示：

表1本发明所涉及的适配体序列

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1.本发明通过对上转换纳米材料进行水溶性改良以装配适配体；通过调节所合成AuNRs的长径比，获得特定的吸收波长；通过RNA和DNA适配体构建上转换纳米材料与AuNRs荧光探针；通过Rnase-H可特异性的切断DNA-RNA杂合链中的RNA。

2.本发明公开的检测方法所利用的上转换荧光可区别于被测物体本身可能存在的下转换荧光，有效避免背景荧光的干扰，提高传感器的灵敏度；所合成AuNRs具有860nm的吸收峰可与上转换材料发生荧光共振能量转移，实现荧光信号的淬灭；Rnase-H实现了检测体系的循环扩增的目的。

3.通过检测不同浓度的OTA和AFB1标准品，采集上转换荧光光谱，确定定量预测模型，在0.1-100μg/L范围内，模型的校正集和预测集相关系数高，交互验证均方根误差小，检测限低，为食品中OTA和AFB1的同时检测提供了广阔的应用前景。

附图说明

图1为OTA和AFB1特异性检测体系的构建原理图。

图2为Probe-RNA1和Probe-RNA2与Rnase-H反应时间(a)以及AuNRs用量(b)的优化图。

图3为不同浓度OTA和AFB1检测的荧光光谱图(a)和定量预测模型(b)图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。本发明包括但不限于以下实施例，凡在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或者拒不改进，都将视为在本发明的保护范围之内。

实施例1：

步骤一，两种上转换纳米材料的制备：

UCNPs1：将氧化钇、氧化镱、氧化铒按照78mol:20mol:2mol的比例溶于5mL三氟乙酸溶液中，再加入氟化钠，得到混合液A，其中氟化钠在混合液中的浓度为10mmol/L；将混合液A转移至含有20mL油胺和20mL 1-十八烯混合有机溶液的三颈烧瓶中，持续充入氮气并进行磁力搅拌，320℃持续加热1h后冷却至室温；用100mL的环己烷和乙醇的混合液(其中环己烷和乙醇的体积比为2:1)充分溶解进行洗涤；洗涤后离心所得沉淀再用纯净水反复清洗，清洗后再次离心得到的沉淀经冷冻干燥最终得到上转换纳米粉末，记为UCNPs1；

UCNPs2：将氧化钇、氧化镱、氧化铥按照78mol:20mol:2mol的比例溶于5mL三氟乙酸溶液中，后续步骤及参数条件同UCNPs1的制备方法，最终得到上转换纳米粉末，记为UCNPs2。

步骤二，上转换纳米材料的修饰：

NH

NH

步骤三，特定发射波长金纳米棒(AuNRs)的制备：

种子液的制备：取5mL浓度为0.5mmol/L HAuCl

生长液(AuNRs溶液)的制备：称取1.8g CTAB加入0.2468g油酸钠溶于50℃的50mL去离子水，冷却到30℃，加入4.8mL 4mmol/L硝酸银，于30℃环境下静置15min，加入50mL1mmol/L HAuCl

步骤四，特异性检测体系的构建：

准确称取10mg的NH

吸取1mL AuNRs分别加入5mL NH

分别向0.5mL的Probe-RNA1和Probe-RNA2中加入0.5mL的OTA和AFB1(浓度均为0.1μg/L、0.4μg/L、1μg/L、2μg/L、4μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L)，再加入0.2μL(60U/μL)的Rnase-H，反应60min后得到待测溶液，即构建OTA和AFB1特异性检测体系。

步骤五，OTA和AFB1的检测：

首先，对已知浓度(0.1μg/L、0.4μg/L、1μg/L、2μg/L、4μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L)的OTA和AFB1待测溶液进行荧光光谱信息的采集，每个对应浓度下采集18条荧光光谱，并按照2:1的比例随机将荧光光谱信息划分成校正集和预测集，结合联合区间偏最小二乘(SiPLS)建立预测模型；

步骤六，玉米中OTA和AFB1的检测：

参照GB 5009.96-2016和GB 5009.22-2016的方法，对玉米样品进行处理，制备样品提取液；然后，向0.5mL的Probe-RNA1和Probe-RNA2中加入0.5mL的样品提取液，再加入0.2μL(60U/μL)的Rnase-H，反应60min后采集荧光光谱；随后将所采集荧光光谱信息导入所建立SiPLS预测模型，经过SiPLS模型计算得到玉米中OTA和AFB1的具体浓度值，实现玉米中OTA和AFB1的同时检测，具体结果见表1。

本发明提供的荧光检测方法与国标法的检测对比结果如表1所示，根据表中的检测结果可知，本发明提供的荧光检测方法与国标法的检测结果基本一致，证明本发明提供的检测方法具有较高的准确性。

表1本发明所构建传感器与国标法分别检测玉米中OTA和AFB1的对比结果

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。