一种同时检测赭曲霉毒素A及黄曲霉毒素B1的荧光适配体传感器制备方法

摘要

本发明涉及了一种同时检测赭曲霉毒素A及黄曲霉毒素B1的荧光适配体传感器制备方法，包括以下步骤：采用PCR退火程序制备DNA双标记链。传感器以由3’端被猝灭基团标记的DNA链S1，5’端被猝灭基团标记的DNA链S2及3’和5’均被荧光基团修饰的DNA链S3杂交而形成。根据响应信号的变化，得到了一种同时检测赭曲霉毒素A及黄曲霉毒素B1的荧光适配体传感器。同其它用于赭曲霉毒素A及黄曲霉毒素B1检测的荧光传感器相比，所制备的荧光适配体传感器具有灵敏度高、重复性好、准确度高的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种同时检测赭曲霉毒素A及黄曲霉毒素B1的荧光适配体传感器制备方法，尤其涉及一种DNA双标记链的制备方法。

背景技术

在粮食的生长期和生产后的贮藏过程中，由于环境因素的影响，粮食往往容易受到各种真菌的污染，因此，粮食及其衍生物中存在霉菌毒素共存的可能性很高。文献报道发现赭曲霉毒素A（OTA）和黄曲霉毒素B1（AFB1）在小麦和玉米中通常自然共生。目前有较多的研究报道OTA与AFB1共存的潜在风险可能由于累积或协同作用而导致更大的毒性，对公众健康造成巨大威胁，特别是婴幼儿。相关研究也发现OTA与AFB1具有协同的细胞毒性作用。AFB1除了具有肾毒性和细胞毒性外，还具有致癌促进作用，增强OTA的遗传毒性和致癌性。因此，迫切需要开发一种能够在单一分析操作中实现同时检测的方法，从而准确评估食品基质中OTA和AFB1的污染程度。目前，许多测定AFB1和OTA的方法已经被开发出来。传统薄层色谱法处理分析样品的具体工作量大，定量检测准确度低。高效液相色谱（HPLC）或高效液相色谱-质谱联用（MS）方法存在设备使用和维护成本高、操作要求高、分析时间长等缺点。虽然免疫分析法可以满足灵敏度、选择性和方便性的要求，但抗体的性质、合成和保留周期限制了抗体在分析方法中的应用。比色法传感器在稳定性和灵敏度方面存在缺陷，而电化学传感器方法由于电极表面的频繁修饰和纳米材料的传感效率的干扰，稳定性和重复性较差。综上所述，基于核酸适配体的荧光传感器方法具有相对显著的优势，特异性强、操作简单、稳定性好，具有相当好的应用前景。

发明内容

本发明涉及一种同时检测赭曲霉毒素A及黄曲霉毒素B1的荧光适配体传感器制备方法。

一种同时检测赭曲霉毒素A及黄曲霉毒素B1的荧光适配体传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述DNA双标记链的制备：由含有23个碱基的DNA链S1和含有26个碱基的DNA链S2，通过碱基互补配对的方式和DNA链S3连接而成。取1~2 μM的DNA链S1，S2和S3各10~20 μL于100~200 μL的离心管中，涡旋充分混匀，置于梯度PCR仪中执行退火程序。最终得到DNA链S3的3’和5’均被荧光基团标记，DNA链S1的3’端被猝灭基团标记，DNA链S2的5’端被猝灭基团标记的DNA双标记链；

所述荧光适配体传感器是以由3’端被猝灭基团标记的DNA链S1，5’端被猝灭基团标记的DNA链S2及3’和5’均被荧光基团修饰的DNA链S3杂交而形成。当样本中含有目标物赭曲霉毒素A及黄曲霉毒素B1时，适配体链与目标物结合，使得荧光基团和猝灭基团彼此靠近，产生很强的FRET效应，造成荧光响应信号的变化，得到了一种同时检测赭曲霉毒素A及黄曲霉毒素B1的荧光适配体传感器。

所述的退火程序为先升温到95~100℃，时间为5~10 min，然后缓慢降温到4~10℃，保持30~45 min。

所述的DNA链S1的3’端及DNA链S3的5’端的猝灭基团分别为BHQ1，BHQ2，TAMRA，Dabcyl中的一种。

所述的修饰DNA链S3的3’和5’端的荧光基团分别为Cy3，Cy5，FAM，ROX，AlexaFluor 488，Alexa Fluor 594中的一种。

所述的DNA链S1的序列为5’-AATGGATGTTGTCTCTCTGT

所述的DNA链S2的序列为5’-TCCCTTTACGCCACCCACACCCGATC-3’。

所述的DNA链S3的序列为5’-GACACAGAGAGACAACACGTGCA-3’。

所述的缓冲溶液为Tris-HCl，PBS，1% BSA中的一种或两种。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1显示了一种同时检测赭曲霉毒素A及黄曲霉毒素B1的荧光适配体传感器的制备方法。

图2显示了同时检测赭曲霉毒素A及黄曲霉毒素B1的荧光适配体传感器的琼脂糖凝胶电泳表征图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

具体步骤如下：

（1）DNA双标记链的制备：由含有23个碱基的DNA链S1和含有26个碱基的DNA链S2，通过碱基互补配对的方式和DNA链S3连接而成。吸取2 μM的DNA链S1、S2和S3各20 μL于100μL的离心管中，涡旋充分混匀，置于梯度PCR仪中执行退火程序。预设定的热变性退火温度程序依次为：95℃下5 min，然后缓慢降温到4℃保持30 min。最终得到DNA链S3的3’和5’分别被Cy3和Cy5标记，DNA链S1的3’端被BHQ

（2）琼脂糖凝胶电泳表征：用3.0%的琼脂糖凝胶对传感器的制备进行表征，电泳结果如图2所示，泳道1的条带表示DNA链S1，泳道2的条带表示DNA链S2、泳道3的条带表示DNA链S3，泳道4的条带表示由DNA链S1、DNA链S2和DNA链S3构成的DNA双标记链。

（3）荧光适配体传感器是以由3’端被BHQ

实施例2

具体步骤如下：

（1）DNA双标记链的制备：由含有23个碱基的DNA链S1和含有26个碱基的DNA链S2，通过碱基互补配对的方式和DNA链S3连接而成。吸取1 μM的DNA链S1、S2和S3各10 μL于100μL的离心管中，涡旋充分混匀，置于梯度PCR仪中执行退火程序。预设定的热变性退火温度程序依次为：95℃下10 min，然后缓慢降温到4℃保持45 min。最终得到DNA链S3的3’和5’分别被FAM和ROX标记，DNA链S1的3’端被TAMRA标记，DNA链S2的5’端被Dabcyl标记的DNA双标记链。

（2）荧光适配体传感器是以由3’端被TAMRA标记的DNA链S1，5’端被Dabcyl标记的DNA链S2及3’和5’分别被FAM和ROX修饰的DNA链S3杂交而形成。当样本中含有目标物赭曲霉毒素A及黄曲霉毒素B1时，适配体链与目标物结合，使得荧光基团和猝灭基团彼此靠近，产生很强的FRET效应，造成响应信号的变化，得到了一种同时检测赭曲霉毒素A及黄曲霉毒素B1的荧光适配体传感器。

所制备的荧光传感器对赭曲霉毒素A及黄曲霉毒素B1的检测具有准确度高，线性范围宽（OTA为0.05~20 ng/mL，AFB1为0.08~10 ng/mL），检测下限低（OTA为0.029 ng/mL，AFB1为0.035 ng/mL）的特点。同时，对实际样品（如红酒和玉米）的检测结果表明所制备的传感器具有非常好的实际应用价值。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。