一种提高发酵乳杆菌DALI02发酵液抑菌能力的制备方法

摘要

本发明提供一种提高发酵乳杆菌DALI02发酵液抑菌能力的制备方法，通过在乳清蛋白酶解液中添加复合低聚糖，经发酵乳杆菌DALI02发酵剂发酵，得到提高抑菌能力的发酵乳杆菌DALI02发酵液；所述乳清蛋白酶解液的制备方法为：乳清蛋白粉添加量为8%~12%w/w，调节pH为6~8，添加木瓜蛋白酶，加酶量为1000~2000 U/g，水解温度为60~70℃，酶解时间为4~8 h，经离心去除沉淀物，高温灭酶后，冷却得到乳清蛋白酶解液；所述复合低聚糖为低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉、水苏糖、低聚木糖按0.2：1：1：1：1比例混合而成；通过本发明，发酵乳杆菌DALI02发酵液抑菌能力显著提升了。

说明书

技术领域

本发明提供一种提高发酵乳杆菌DALI02发酵液抑菌能力的制备方法，属于食品生物发酵与功能食品领域。

技术背景

发酵乳杆菌DALI02（

益生菌被定义为“当以足够的量摄入时，能给宿主带来健康益处的活微生物”，而益生元是“被宿主微生物选择性利用并带来健康益处的底物”。另一方面，益生元是不可存活的底物，作为宿主所含有益微生物的营养物质，包括施用的益生菌菌株和常驻微生物。在益生元的最新定义中，预计它可以通过活宿主微生物的选择性利用，引发任何宿主微生物生态系统的变化，而不仅仅是肠道。

大量研究表明，益生菌能够抑制致病菌（革兰氏阴性菌和过氧化氢酶阳性细菌）的生长和繁殖，进而调节肠道微生态菌群结构平衡。临床研究表明某些益生菌可以通过调节肠道菌群结构，辅助治疗轮状病毒、梭菌及抗生素等引起的多种腹泻和代谢功能紊乱。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术存在的缺陷，提供一种提高发酵乳杆菌DALI02发酵液抑菌能力的制备方法。

本发明是这样实现的：一种提高发酵乳杆菌DALI02发酵液抑菌能力的制备方法，其特征在于：通过在乳清蛋白酶解液中添加复合低聚糖，经发酵乳杆菌DALI02发酵剂发酵，得到提高抑菌能力的发酵乳杆菌DALI02发酵液；

所述乳清蛋白酶解液的制备方法为：乳清蛋白粉添加量为8%~12%w/w，调节pH为6~8，添加木瓜蛋白酶，加酶量为1000~2000 U/g，水解温度为60~70℃，酶解时间为4~8 h，经离心去除沉淀物，高温灭酶后，冷却得到乳清蛋白酶解液；

所述复合低聚糖为低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉、水苏糖、低聚木糖按0.2：1：1：1：1比例混合而成；

发酵乳杆菌DALI02发酵剂制备时，将1代菌株按3%接种量接种于MRS液体培养基，置于37℃培养箱培养18 h，得到发酵乳杆菌DALI02发酵剂；

其中，MRS液体培养基制备时，大豆蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、葡萄糖20g、Tweeen 80 1 mL、磷酸二氢钠2 g、无水乙酸钠5 g、柠檬酸三胺2 g、硫酸锰0.02 g、硫酸镁 0.1 g加入蒸馏水1 L，调节pH至6.2左右，121℃、15 min灭菌，得到MRS液体培养基。

在酶解乳清蛋白酶解液中，添加3.0%~4.6% w/w的复合低聚糖，经常规灭菌后，接种2%~5% w/w的发酵乳杆菌DALI02发酵剂，经37℃培养18~28 h制备而成，得到提高抑菌能力的发酵乳杆菌DALI02发酵液。

利用该方法制备的提高抑菌能力的发酵乳杆菌DALI02发酵液用于制备强抑菌能力的发酵乳饮料、浓缩发酵液、冻干发酵粉产品。

乳清蛋白酶解液的制备时，将8%~12% w/w的乳清蛋白粉溶于50℃的水中，用0.1mol/L的NaOH调节pH为6~8，添加木瓜蛋白酶，加酶量为1000~2000 U/g，酶解温度为60~70℃，酶解时间为4~6 h，经离心去除沉淀物，高温灭酶后，冷却得到乳清蛋白酶解液。

发酵乳杆菌DALI02（

本发明方法先进科学，通过本发明，一种提高发酵乳杆菌DALI02发酵液抑菌能力的制备方法，本发明所用的发酵乳杆菌DALI02（

本发明所用指示菌株大肠杆菌（

本发明涉及以下培养基：

1、LB固体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠10 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，调节pH至7.0左右，121℃、15 min灭菌。

2、LB液体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠10 g、蒸馏水1 L，调节pH至7.0左右，121℃、15 min灭菌。

3、MRS液体培养基：大豆蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、葡萄糖20 g、Tweeen80 1 mL、磷酸二氢钠2 g、无水乙酸钠5 g、柠檬酸三胺2 g、硫酸锰0.02 g、硫酸镁 0.1 g，蒸馏水1 L，调节pH至6.2左右，121℃、15 min灭菌。

4、MRS固体培养基：大豆蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、葡萄糖20 g、Tweeen80 1 mL、磷酸二氢钠2 g、无水乙酸钠5 g、柠檬酸三胺2 g、硫酸锰0.02 g、硫酸镁 0.1 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L，调节pH至6.2左右，121℃、15 min灭菌。

一、菌株的活化传代；

1、发酵乳杆菌DALI02：将1代菌株按3%接种量接种于MRS液体培养基，置于37℃培养箱培养18 h，备用。测定乳酸菌活菌数量采用MRS固体培养基。

2、大肠杆菌（

二、乳清发酵液的制备；

将8%~12%的乳清蛋白粉溶于50℃的水中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH为6~8，添加木瓜蛋白酶，加酶量为1000~2000 U/g，酶解温度为60~70℃，酶解时间为4~6 h，经离心去除沉淀物，高温灭酶后，冷却备用。

三、发酵原料的制备；

1、 复合低聚糖的制备：按低聚果糖:低聚半乳糖:菊粉:水苏糖:低聚木糖为0.2:1:1:1:1比例，充分混匀后，备用。

2、 向酶解乳清蛋白水解液中添加3.0%~4.6%的复合低聚糖，然后经过灭菌后，冷却到37℃左右，备用。

四、发酵；

接种2%~5%的发酵乳杆菌DALI02发酵剂到灭菌的混合料中，在37℃培养18~28 h，即为发酵乳杆菌DALI02乳清发酵液。

五、抑制病原指示菌能力测定；

1、 将致病菌活化二代，以生理盐水调整菌液浓度至OD

2、 抑制大肠杆菌能力；

添加复合低聚糖的发酵乳杆菌DALI02乳清发酵液抑制大肠杆菌的能力得到显著增强（

3、抑制沙门氏菌能力；

添加复合低聚糖的发酵乳杆菌DALI02乳清发酵液抑制沙门氏菌的能力得到显著增强（

4、抑制枯草芽孢杆菌能力；

添加复合低聚糖的发酵乳杆菌DALI02乳清发酵液抑制枯草芽孢杆菌的能力得到显著增强（

5、抑制金黄色葡萄球菌能力；

添加复合低聚糖的发酵乳杆菌DALI02乳清发酵液抑制大肠杆菌的能力得到显著增强（

本发明涉及一种提高发酵乳杆菌DALI02发酵液抑菌能力的制备方法，该方法是通过添加复合低聚糖与发酵乳杆菌DALI02在乳清蛋白水解液中进行发酵，从而提高了发酵乳杆菌DALI02发酵液的抑菌能力。本发明将益生元、益生菌与乳清水解液进行紧密结合，测定发酵乳杆菌DALI02发酵液对腐败或致病菌的抑菌能力，发现发酵乳杆菌DALI02发酵液抑菌能力显著提升了，且具有广谱抑菌能力。本发明可用于具有良好抑菌能力的发酵乳饮料等食品、功能性食品与药品的生产。

具体实施方式

实施例1：利用发酵乳杆菌DALI02制备高抑菌能力的发酵液；

将低聚果糖:低聚半乳糖:菊粉:水苏糖:低聚木糖按0.2:1:1:1:1的比例混合制备成复合低聚糖。将复合低聚糖按3.5%的添加量添加到50℃的酶解乳清液中，充分混匀后，经95℃热处理10 min，冷却至37℃，按2%接种量接入发酵乳杆菌DALI02发酵剂，在37℃下发酵22 h，冷却，采用无菌灌装，得到具有较强抑菌能力的发酵液。

实施例2：利用发酵乳杆菌DALI02制备冻干粉活菌制剂；

将低聚果糖:低聚半乳糖:菊粉:水苏糖:低聚木糖按0.2:1:1:1:1的比例混合制备成复合低聚糖。将复合低聚糖按3.5%的添加量添加到50℃的酶解乳清液中，充分混匀后，经95℃热处理10 min，冷却至37℃，按2%接种量接入发酵乳杆菌DALI02发酵剂，在37℃下发酵22 h，冷却，采用无菌灌装，得到发酵液，经过冷却离心，收集菌泥，加入保护剂，真空冻干至含水量小于3%，制备冻干粉活菌制剂。也可以压碎成粉末状，然后再与奶粉、风味剂等制成粉状或片状等产品形式。

实施例1和2中的乳清水解液的制备方法；

所述的乳清水解液的制备方法为乳清蛋白粉添加量为8%~12%w/w，调节pH为6~8，添加木瓜蛋白酶，加酶量为1000~2000 U/g，水解温度为60~70℃，酶解时间为4~8 h，经离心去除沉淀物，高温灭酶后，冷却备用。

发酵乳杆菌DALI02发酵剂制备时，将1代菌株按3%接种量接种于MRS液体培养基，置于37℃培养箱培养18 h，得到发酵乳杆菌DALI02发酵剂；

其中，MRS液体培养基制备时，大豆蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、葡萄糖20g、Tweeen 80 1 mL、磷酸二氢钠2 g、无水乙酸钠5 g、柠檬酸三胺2 g、硫酸锰0.02 g、硫酸镁 0.1 g加入蒸馏水1 L，调节pH至6.2左右，121℃、15 min灭菌，得到MRS液体培养基。

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的保护范围。