一种福尔马林固定石蜡包埋样本提取病原微生物核酸的方法

摘要

本发明提供了一种福尔马林固定石蜡包埋样本提取病原微生物核酸的方法，该方法包括如下步骤：向装有福尔马林固定石蜡包埋样本的离心管中加入二甲苯，离心；弃去离心管中的二甲苯，加入无水乙醇进行离心；弃去离心管中的无水乙醇，孵育直至无水乙醇全部蒸发；向离心管中加入超纯水，并吹打混匀至匀质；将匀质液澄清，再涡旋，加入洗脱缓冲液离心，纯化得到病原微生物核酸；本发明的病原微生物核酸宏基因的结果显示都在10％以下，经过宏基因高通量检测证实确实有效的方法，且去人源性的核酸能力极强，故本发明的福尔马林固定石蜡包埋样本提取病原微生物核酸的方法可以最大程度地去除人源背景，做到仅抽提病原微生物核酸的目的。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种福尔马林固定石蜡包埋样本提取病原微生物核酸的方法。

背景技术

核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，根据化学组成不同，核酸可分为脱氧核糖核酸(简称DNA)和核糖核酸(简称RNA)。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用，因而核酸在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。核酸的研究可从本质上揭示微生物的结构、组成，甚至是致病机理的神秘面纱，可以更有效地研究如何预防、治疗由此产生的疾病，因此，对核酸的研究有着至关重要的意义。

针对目前临床的需求，想要对一些回顾性标本进行宏基因组检测。众所周知，石蜡标本为回顾性研究的首选，故针对临床痛点如何找到一个可以仅提取石蜡标本中病原微生物核酸的方法迫在眉睫。另外，目前病原微生物核酸的提取都是基于新鲜标本(血液、肺泡灌洗液、脓液等)，市面上并无专门从石蜡标本中单独抽提病原微生物的核酸的方法。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种福尔马林固定石蜡包埋样本提取病原微生物核酸的方法。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种福尔马林固定石蜡包埋样本提取病原微生物核酸的方法，其包括如下步骤：

(1)、向装有福尔马林固定石蜡包埋样本的离心管中加入二甲苯，离心；

(2)、弃去离心管中的二甲苯，加入无水乙醇进行离心；

(3)、弃去离心管中的无水乙醇，孵育直至无水乙醇全部蒸发；

(4)、向离心管中加入超纯水，并吹打混匀至匀质；

(5)、将步骤(4)的匀质液澄清，再涡旋，加入洗脱缓冲液离心，纯化得到病原微生物核酸。

优选地，步骤(1)中，离心的转速可以为12000-15000rpm，优选为13000rpm；离心的时间可以为1-4min，优选为2min。

优选地，步骤(2)中，离心的转速可以为12000-15000rpm，优选为13000rpm；离心的时间可以为1-4min，优选为2min。

优选地，步骤(3)中，孵育的温度可以为50-60℃，优选为56℃；孵育的时间可以为1-10min，优选为5min。

优选地，步骤(5)中，洗脱缓冲液可以为90-100μL，优选为90μL。

优选地，步骤(5)中，涡旋的转速可以为1200-1800rpm，优选为1500rpm；涡旋的时间可以为1-4min，优选为3min。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明的病原微生物核酸宏基因的结果显示都在10％以下，经过宏基因高通量检测证实确实有效的方法，且去人源性的核酸能力极强，故本发明的方法可以最大程度地去除人源背景，做到仅抽提病原微生物核酸的目的。

具体实施方式

本发明提供了一种福尔马林固定石蜡包埋样本提取病原微生物核酸的方法。

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明。下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的福尔马林固定石蜡包埋样本提取病原微生物核酸的方法包括如下步骤：

(1)、向装有蜡卷(即福尔马林固定石蜡包埋样本)的离心管中加入1mL二甲苯，13000rpm离心2min。

(2)、弃去离心管中的二甲苯，加入1mL无水乙醇进行离心，13000rpm离心2min。

(3)、弃去离心管中的无水乙醇，56℃孵育5min直至无水乙醇全部蒸发。

(4)、向离心管中加入200μL超纯水，用移液器吹打混匀至匀质。

(5)、向珠磨管中加入400μL澄清液。

(6)、将步骤(4)的200μL组织匀质液样品加入步骤(5)含有400μL澄清液的珠磨管中。

(7)、使用带微量离心管适配器的涡旋仪，以1500rpm振荡15min。

(8)、在15000rpm下离心3min，取300μL上清液(澄清的裂解物)至一个新的离心管，并在离心管中加入10μL蛋白酶K。

(9)、用移液器上下吹打数次，使澄清的裂解物与蛋白酶K混合均匀。在室温下孵育2min。

(10)、向每个离心管中加入720μL裂解液/结合液/磁珠混合物(350μL裂解液+350μL结合液+20μL磁珠)，1500rpm涡旋3min，瞬时离心10s。

(11)、将离心管放在磁力架上，室温孵育3min。

(12)、保持离心管放置在磁力架上，小心吸取并弃去上清液。

(13)、从磁力架上取下离心管，向每个离心管中加入500μL洗涤液1，1500rpm涡旋1min，瞬时离心10s。

(14)、将离心管放至磁力架上，室温孵育1min。

(15)、保持离心管放置在磁力架上，小心吸取并弃去上清液。

(16)、从磁力架上取下离心管，向每个离心管中加入500μL洗涤液2，1500rpm涡旋1min，瞬时离心10s。

(17)、将离心管放至磁力架上，室温孵育1min。

(18)、保持离心管放置在磁力架上，小心吸取并弃去上清液。

(19)、保持离心管放置在磁力架上，打开管盖，室温干燥磁珠5min。

(20)、使用20μL移液器吸走残留的洗涤液2。

(21)、从磁力架上取下离心管，向每个离心管中加入90μL洗脱缓冲液，1500rpm涡旋3min，瞬时离心10s。

(22)、将离心管放至磁力架上，室温孵育3min。

(23)、保持离心管放置在磁力架上，将纯化得到的核酸转移到标记好的洁净的离心管或板中。

其中，在步骤(5)中，澄清液为试剂盒自带。

在步骤(10)中，结合液为试剂盒自带，磁珠购于赛默飞世尔科技公司。

将上述的病原微生物核酸进行如下宏基因组检测，检测结果如表1和表2所示：

表1

检测结论：

本次检出序列：结核分歧杆菌1条。

表2

检测结论：

本次检出序列：结核分歧杆菌1条。

由表1和表2可知，宏基因的结果显示都在10％以下，即经宏基因测序的结果显示此方法可以最大程度的去除人源背景，做到仅抽提病原微生物核酸的目的。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。