一种评估西罗莫司药物代谢的引物组及试剂盒及评估方法

摘要

本发明公开了一种评估西罗莫司药物代谢的引物组及试剂盒及评估方法，属于分子生物学和生物医药领域。本发明的试剂盒，包含的2对特异性引物，能准确、特异性的扩增出CYP3A5rs15524、CYP3A5rs4646453的基因片段，通过标准PCR‑限制性片段长度多态性方法进行基因分型，能够准确检测各位点的基因型。本发明的评估方法基于西罗莫司相关的代谢酶在人体内的表达情况的个体差异，选取与西罗莫司在不同时间点的代谢显著相关(P<0.05)的CYP3A5的CYP3A5rs15524和CYP3A5rs4646453两个SNP位点，能在患者服药前预测患者药物代谢情况，从而个体化设计西罗莫司的用药方案，减少患者调整西罗莫司用量以达到最佳治疗浓度的时间，对于指导临床上使用西罗莫司进行免疫抑制治疗以及增加西罗莫司的临床安全性均具有积极的意义。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种评估西罗莫司药物代谢的引物组及试剂盒及评估方法。

背景技术

世界卫生组织2020年12月9日发布的《2019年全球卫生估计报告》显示，慢性肾脏疾病已上升为全球十大死因之一。根据全国性横断面流行病学调查结果显示，我国成人慢性肾病患病率约为10.8％，按照中国总人口数量估计，中国慢性肾病患者约为1.5亿。肾脏疾病大多起病较为隐匿，早期或最初发病的几年里患者的不适症状均较为轻微，常常被忽略，待出现明显症状时往往已发展为肾脏病的终末期。肾移植是终末期肾病患者最有效且生存期最长的肾脏替代方案，肾移植术后的问题主要为肾排斥反应，术后患者只需要服用抗排斥药物并定期复查，基本上不影响正常的工作和生活。

目前西罗莫司是肾移植术后的二线免疫抑制剂，具有无肾毒性和神经毒性的优点，发明人早期研究表明在受者肾移植术后早期转换为含西罗莫司的四联低剂量免疫抑制方案可有效改善移植肾功能，且未增加不良反应的发生风险。然而，术后早期应用西罗莫司可能导致创口愈合障碍以及淋巴囊肿等外科并发症；同时，西罗莫司在不同患者之间存在巨大药物代谢动力学差异，复杂的药物代谢会导致肾移植术后早期一系列外科并发症，因此西罗莫司的临床应用一直受到很大的限制。因此，血清药物浓度监测正广泛应用于西罗莫司使用中的个体化浓度监测，用以在维持足够的治疗量的西罗莫司血清药物浓度的同时最大程度地降低西罗莫司的术后早期外科并发症。

现有的血清药物浓度监测一般采用色谱法，对血液样本中与血浆蛋白结合或血浆中游离的药物在全血中的浓度进行检测。该检测方法快速简便，能够有效检测当前血样中药物浓度。但具该方法具有滞后性，只能在患者服用一定标准化的起始剂量后，检测其血清药物浓度，再依据检测浓度，调整药物使用量。并且，由于西罗莫司相关的代谢酶在人体内的表达情况具有较大的个体差异，即使给予用公斤体重校正过的相同的起始西罗莫司计量，仍有一部分肾移植术后患者的西罗莫司血清药物浓度不在其治疗窗内，当血清药物浓度过低时，将导致患者发生急性排斥反应或承受更大的急性排斥反应的风险；当血清药物浓度过高时，将导致肾移植术后相关外科并发症的风险增加。

因此急需一种可以在患者服药前预测患者药物代谢情况的方法，从而个体化设计西罗莫司初始服用剂量，减少患者调整西罗莫司用量以达到最佳治疗浓度的时间，更好的治疗患者。

发明内容

1.要解决的问题

本发明针对现有的血清中西罗莫司药物浓度检测方法只能在患者服用一定标准化的起始剂量后才可以检测，再依据检测浓度，调整药物使用量，使得药物调整具有滞后性，从而增加患者的血清药物浓度过低或过高而导致急性排斥反应或术后早期手术相关临床并发症的风险的问题，根据西罗莫司相关的代谢酶在人体内的表达情况的个体差异，开发一种西罗莫司药物代谢的评估方法，能在患者服药前预测患者药物代谢情况，从而个体化设计西罗莫司的用药方案，从而减少患者调整西罗莫司用量以达到最佳治疗浓度的时间尤为重要。

2.技术方案

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种西罗莫司药物代谢的评估方法，该方法包括如下步骤：

S1：确认患者CYP3A5 rs15524以及CYP3A5 rs4646453两个位点的基因型；

S2：根据下列公式确定西罗莫司血药浓度：

西罗莫司血药浓度＝-24.223-69.272×性别-1.368×年龄(年)+0.204×移植后时间(天)+24.886×rs4646453-4.627×rs15524×每天服用西罗莫司的单位体重剂量比，

其中，公式中各参数赋值如下：

性别：女性，性别＝0，男性，性别＝1；

rs4646453基因型：AA时，rs4646453＝11；CA时，rs4646453＝21；CC时，rs4646453＝22；

rs15524基因型：AA时，rs15524＝11；AG时，rs15524＝13；GG时，rs15524＝33。

西罗莫司在人体内主要通过细胞色素P450酶系的CYP3A4和CYP3A5发生脱甲基反应和羟化反应进行代谢，因此，CYP3A5在西罗莫司的代谢中起到了重要的作用，测得相关位点的基因型，能够判断西罗莫司在患者体内的代谢状态。单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)被称为“第三代DNA遗传标记”，具有分布密集、数量庞大、频率高、属二态性标记、存在相对稳定的特点，被认为是应用前景最好的遗传标记物。因此，通过检测西罗莫司相关代谢基因的SNP位点，得到患者的基因型，可有效而稳定地在肾移植术后早期预测西罗莫司在受者体内的代谢状态。发明人通过研究发现CYP3A5基因上两个SNP位点(CYP3A5 rs4646453和CYP3A5 rs15524)的突变，能够揭示了西罗莫司在患者体内的代谢情况。

本发明还提供了一种检测CYP3A5基因上rs15524和rs4646453两个SNP位点基因型的引物组，包括引物对1和引物对2，其序列如表1所示：

表1 PCR引物组序列

本发明还提供了一种检测CYP3A5基因上rs15524和rs4646453两个SNP位点基因型的的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组。

优选地，上述试剂盒还包括(1)总RNA提取试剂；(2)PCR扩增试剂和测序试剂。

优选地，上述总RNA提取试剂包括：Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇、去离子甲酰胺。

优选地，上述PCR扩增和测序试剂包括：上述两位点的PCR引物组、dNTP、PCRbuffer、Taq酶、内参(G3PD)特异性引物、焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate，DEPC)水、双蒸水等。

本发明还提供了上述试剂盒的应用方法，包括如下步骤：

S11：血标本总RNA的提取；

S12：cDNA的合成；

S13：目的基因PCR扩增；

S14：基因型结果分析。

优选地，上述S11：血标本总RNA的提取，包括如下步骤：

(1)取全血标本2mL置于冰上，加入1mLTrizol进行裂解并静置5min；

(2)5min加入0.2mL氯仿，混合后分装至1.5mL的离心管中，用涡旋仪剧烈振荡15s，15～30℃条件下孵育2～3min，将离心管4℃12000rpm离心15min后取上清至新离心管中，每管加入与上清同体积的异丙醇，15～30℃条件下静置10min；

(3)将离心管4℃12000rpm离心10min后弃上清，加入75％无水乙醇清洗沉淀，然后4℃7500rpm离心5min；

(4)离心过后弃去上清，室温下晾干沉淀，干燥后每管按需要加入去离子甲酰胺吹打混匀，置于-70℃保存。

优选地，上述S12：cDNA的合成，包括如下步骤：

(1)取0.5mL的微量离心管并加入1～5μg S11中提取出的总RNA，适量加入焦碳酸二乙酯水定容至11μL，加入10μM的Oligo(dT)12～18μL，振荡混匀后离心；

(2)将离心管置于70℃环境中加热10min，随后将离心管插入冰块在0℃中冷却1min以上；

(3)在离心管中加入混合物，在室温条件下，将各试剂震荡混合并且离心，随即置于42℃环境中2～5min,各试剂比例如下：

(4)在离心管中加入1μL的SuperscriptⅡ并置于42℃水浴锅中孵育50min；

(5)随后将离心管转移至70℃环境下加热15min终止孵育；

(6)将离心管置于冰上加入1μL的RNase H，接着置于37℃环境中孵育20min，最后置于-20℃保存待用；

优选地，上述S13：目的基因PCR扩增，包括如下步骤：

(1)按照比例加入以下试剂至0.5mL的PCR管中：

(2)在PCR管中加入双蒸水定容至50μL并震荡混匀，室温环境下进行离心；

(3)将PCR管置于PCR仪中，设置相应程序进行检测并对数据进行相应的分析。

优选地，上述S14：基因型结果分析，包括如下步骤：

对步骤S13中的扩增片段进行测序，获得基因型。

优选地，上述获得基因型选用软件对测序结果进行分析。更优选地，通过htSNPer1.0软件分析。

本发明还提供了上述检测CYP3A5基因上的两个SNP位点(CYP3A5 rs15524、CYP3A5rs4646453)基因型的引物组、试剂盒及检测方法在西罗莫司药物代谢的评估方法中的应用。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的一种西罗莫司药物代谢的评估方法，据西罗莫司相关的代谢酶在人体内的表达情况的个体差异，选取与西罗莫司在不同时间点的代谢显著相关(P<0.05)的CYP3A5的两个SNP位点(CYP3A5 rs15524和CYP3A5 rs4646453)，能在患者服药前预测患者药物代谢情况，从而个体化设计西罗莫司的用药方案，减少患者调整西罗莫司用量以达到最佳治疗浓度的时间。

(2)本发明提供的检测引物组及试剂盒，包含的2对特异性引物能准确、特异性的扩增出CYP3A5 rs15524、CYP3A5 rs4646453的基因片段，通过标准PCR-限制性片段长度多态性方法进行基因分型，能够准确检测各位点的基因型。

(3)本发明提供的一种西罗莫司药物代谢的评估方法，是基于两个SNP位点基因型显著相关，且基因型的确定步骤简单、结果准确的基础上，对于指导临床上使用西罗莫司进行免疫抑制治疗以及增加西罗莫司的临床安全性均具有积极的意义。

(4)本发明提供的一种西罗莫司药物代谢的评估方法，是建立在大样本肾移植受者的研究结果上，方法准确、高效、具有较高的实用性，为综合患者病情及药理学作用特点制定适宜的西罗莫司给药方案提供依据。

附图说明

图1：CYP3A5上两个显著位点不同基因突变型对不同时间点西罗莫司代谢的影响，其中A、B、C是rs4646453位点，D、E、F是rs15524位点；

图2：为使用本发明的方法对验证队列中西罗莫司代谢状态预测能力的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。

浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。

实施例1

本实施例提供CYP3A5基因上rs4646453和rs15524位点基因型与西罗莫司在患者体内的代谢的关系。CYP3A5是西罗莫司代谢相关的重要基因，其中rs4646453和rs15524位点的基本信息如表2所示。

表2 SNP位点的基本信息

根据表2可知，rs4646453和rs15524位点可能的基因型如表3所示。

表3 SNP各位点可能的基因型

从图1或表4中可以看出，CYP3A5基因上两个SNP位点(CYP3A5 rs4646453和CYP3A5rs15524)的突变与西罗莫司在患者体内的代谢显著性相关，SNP各位点可能的基因型能够揭示了西罗莫司在患者体内的代谢情况。

表4 CYP3A5基因上的SNP位点与西罗莫司代谢之间的关系

备注:P值小于0.05为显著。

实施例2

本实施例提供本发明的评估方法用于预测患者的西罗莫司血药浓度。

该研究纳入了101例在本中心(南京医科大学第一附属医院肾移植中心)完成肾脏移植手术的受者，该研究设计通过了南京医科大学第一附属医院的伦理委员会审批。

采用本发明的评估方法预测患者的西罗莫司血药浓度/单位体重剂量比，包括如下步骤：

S1：确定患者基本信息

患者，24岁，男性，术后未发生肾功能延迟恢复。

S2：确定患者2个位点的基因型，通过本发明提供的试剂盒及方法进行检测，包括：

S21：血标本总RNA的提取：

(1)取全血标本2mL置于冰上，加入1mLTrizol进行裂解并静置5min；

(2)5min加入0.2mL氯仿，混合后分装至1.5mL的离心管中，用涡旋仪剧烈振荡15s，15～30℃条件下孵育2～3min，将离心管4℃12000rpm离心15min后取上清至新离心管中，每管加入与上清同体积的异丙醇，15～30℃条件下静置10min；

(3)将离心管4℃12000rpm离心10min后弃上清，加入75％无水乙醇清洗沉淀，然后4℃7500rpm离心5min；

(4)离心过后弃去上清，室温下晾干沉淀，干燥后每管按需要加入去离子甲酰胺吹打混匀，置于-70℃保存。

S22：cDNA的合成：

(1)取0.5mL的微量离心管并加入1～5μg提取出的RNA，适量加入焦碳酸二乙酯水定容至11μL，加入10μM的Oligo(dT)12～18μL，振荡混匀后离心；

(2)将离心管置于70℃环境中加热10min，随后将离心管插入冰块在0℃中冷却1min以上；

(3)在离心管中加入混合物，在室温条件下，将各试剂震荡混合并且离心，随即置于42℃环境中2～5min,各试剂比例如下：

(4)在离心管中加入1μL的SuperscriptⅡ并置于42℃水浴锅中孵育50min；

(5)随后将离心管转移至70℃环境下加热15min终止孵育；

(6)将离心管置于冰上加入1μL的RNase H，接着置于37℃环境中孵育20min，最后置于-20℃保存待用。

S23：目的基因PCR扩增

(1)按照比例加入以下试剂至0.5mL的PCR管中：

(2)在PCR管中加入双蒸水定容至50μL并震荡混匀，室温环境下进行离心；

(3)将PCR管置于PCR仪中，设置相应程序进行检测并对数据进行相应的分析。

S24：基因型的确定：

通过htSNPer1.0软件分析，该患者各位点的基因型为：rs15524基因型：AA；rs4646453基因型：CC。

S3：根据下列公式确定西罗莫司血药浓度：

西罗莫司血药浓度＝-24.223-69.272×性别-1.368×年龄(年)+0.204×移植后时间(天)+24.886×rs4646453-4.627×rs15524×每天服用西罗莫司的单位体重剂量比，

其中，公式中各参数赋值如下：

性别：女性，性别＝0，男性，性别＝1；

rs4646453基因型：AA时，rs4646453＝11；CA时，rs4646453＝21；CC时，rs4646453＝22；

rs15524基因型：AA时，rs15524＝11；AG时，rs15524＝13；GG时，rs15524＝33。

根据基本信息及基因型测定结果，各参数赋值如下：

男性，则性别＝1；

年龄＝24；

rs15524基因型为AA，则rs15524＝11；

rs4646453基因型为CC，则rs4646453＝22；

该患者术后30天体重为76.5kg，西罗莫司服用剂量为1mg/天。

代入计算，该患者术后90天的西罗莫司预期谷浓度为：

-24.223-69.272×1-1.368×24+0.204×90+24.886×22-4.627×11×1/76.5＝388.628＝5.08ng/mL。而该患者在术后90天实测的西罗莫司谷浓度为5.07ng/mL，与预测谷浓度基本相同。

实施例3

纳入另外101例肾移植受者作为验证组，跟踪监测其术后的西罗莫司血药浓度(患者一般信息见表5)，包括：

(1)提取101例患者外周血的DNA标本，采用qRT-PCR方法检测预测公式中的两个位点(rs15524、rs4646453)。

(2)赋值，根据下列条件进行赋值。

性别：女性，性别＝0，男性，性别＝1；

rs4646453基因型：AA时，rs4646453＝11；CA时，rs4646453＝21；CC时，rs4646453＝22；

rs15524基因型：AA时，rs15524＝11；AG时，rs15524＝13；GG时，rs15524＝33。

(3)将上述赋值代入公式得到西罗莫司血药浓度：

西罗莫司血药浓度＝-24.223-69.272×性别-1.368×年龄(年)+0.204×移植后时间(大)+24.886×rs4646453-4.627×rs15524×每大服用西罗莫司的单位体童剂量比，

(4)收集了上述101例患者术后相应时间点的西罗莫司药物浓度，并计算出西罗莫司血药浓度。

结果分析：结果如图2所示，该预测公式的预测能力(AUC，曲线下面积)为79.1％，其95％可信区间为70.4～87.8％。因此，上述方法可有效预测肾移植术后受者体内西罗莫司的代谢状态。

表5验证队列纳入患者的一般信息